Структурная организация гена у прокариот. Структура генов у прокариот и эукариот
1. Общие свойства генетического материала. Уровни организации генетического аппарата .
Наследственность и изменчивость являются фундаментальными свойствами живого, так как характерны для живых существ любого уровня организации. Наука, изучающая закономерности наследственности и изменчивости, называется ГЕНЕТИКОЙ
НАСЛЕДСТВЕННОСТЬ - это свойство живых систем передавать из поколения в поколение особенности морфологии, функции и индивидуального развития в определенных условиях среды.
ИЗМЕНЧИВОСТЬ - это способность дочерних организмов отличаться от родительских форм морфологическими и физиологическими признаками и особенностями индивидуального развития.
НАСЛЕДОВАНИЕ - это способ передачи генетической информации: через половые клетки - при половом размножении, или через соматические - при бесполом, т.е. материальная основа яйцеклетка и сперматозоид, или соматическая клетка.
НАСЛЕДУЕМОСТЬ - это степень соотношения наследственности и изменчивости.
ГЕН - это единица наследственности и изменчивости. По современгны представлениям ген - это участок молекулы ДНК, дающий информацию о синтезе определенного полипептида. Набор генов организма, которые он получает от своих родителей, называется ГЕНОТИПОМ, а содержание генов в гаплоидном наборе хромосом - ГЕНОМОМ.
Совокупность всех внешних и внутренних признаков организма называется ФЕНОТИПОМ, а отдельный признак - ФЕНОМ. Например, форма носа, ушной раковины, пальцев ног и рук, цвет волос - внешние фенотипические признаки, особенности строения желудка, содержание лейкоцитов и эритроцитов в крови - внутренние фенотипические признаки.
ГЕНЕТИЧЕСКИЙ МАТЕРИАЛ - компоненты клетки, структурно-функциональное единство которых обеспечивает хранение, реализацию и передачу наследственной информации при вегетативном и половом размножении. Генетический материал обладает универсальными свойствами живого: дискретностью, непрерывностью, линейностью, относительной стабильностью
ДИСКРЕТНОСТЬ генетического материала, т.е. существование гена, хромосомы (группы сцепления), генома, выявляется в виде: множества аллелей, составляющих группу сцепления, множества групп сцепления, составялющих геном.
НЕПРЕРЫВНОСТЬ генетического материала (физическая целостность хромосомы) выявляют в виде сцепления множества генов между собой.
ЛИНЕЙНОСТЬ (одномерность записи генетической информации) - в определенной последовательности генов в пределах групп сцепления или сайтов в пределах гена.
ОТНОСИТЕЛЬНАЯ СТАБИЛЬНОСТЬ или способность к конвариантной редупликации, т.е. возникновение и сохранение вариантов в ходе возспроизведения, выявляют в виде мутационной изменчивости.
Всеми этими свойствами обладают молекулы ДНК или реже РНК (у некоторых вирусов), в которых закодирована наследственная информация.
Основными свойствами генетического материала являются:
1. Ген хранит и передает информацию.
2. Ген способен к изменению генетической информации (мутации).
3. Ген способен к репарации и ее передаче от поколения к поколению (процесс восстановления природной структуры ДНК, поврежденной при нормальном биосинтезе ДНК в клетке химическими или физическими агентами).
4. Ген способен к реализации - синтезу белка, кодируемого геном при участии двух матричных процессов: транскрипции и трансляции.
5. Генетический материал обладает устойчивостью. Устойчивость генетического материала обеспечивается: - диплоидным набором хромосом; - двойной спиралью ДНК; - вырожденностью генетического кода; - повтором некоторых генов; - репарацией нарушенной структуры ДНК.
Дискретность гена заключается в наличии субъединиц. Элементарная единица изменчивости, единица мутации названа МУТОНОМ, а единица рекомбинации - РЕКОНОМ. Минимальные размеры мутона и рекона равны 1 паре нуклеотидов и называются с а й т. Таким образом САЙТ - это структурная единица гена.
Согласно современным, уточненным представлениям, ГЕН - это участок молекулы геномной нуклеиновой кислоты, характеризуемый специфичной для него последовательностью нуклеотидов, представляющий единицу функции, отличной от функции других генов и способный изменяться путем мутирования. Гены неоднородны. Их делят на структурные и функциональные.
Основными первичными функциями генов являются хранение и передача генетической информации. Передача генетической информации происходит при редупликации ДНК (при размножении клеток) и от ДНК через и-РНК к белку (при обычном функционировании клеток).
Система записи генетической информации в молекулах нуклеиновых кислот в виде определенной последовательности нуклеотидов называется ГЕНЕТИЧЕСКИМ КОДОМ. Явление соответствия порядка нуклеотидов в молекуле ДНК порядку аминокислот в молекуле белка называется КОЛИНЕАРНОСТЬЮ.
ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОД - система записи, свойственная всем живым организмам
Свойства генетического кода:
1) универсальность - один триплет кодирует одну и ту же аминокислоту у всех живых существ;
2) триплетность - т.е. одной аминокислоте соответствуют три рядом расположенных нуклеотида;
3) неперекрываемость - один нуклеотид не может входить одновременно в два и больше триплета;
4) вырожденность (избыточность) - одну аминокислоту могут кодировать несколько триплетов;
5) без разделительных знаков.
1. Генетика - наука о наследственности и изменчивости - фундаментальных свойствах живого.
2. Общие понятия генетического материала и его свойствах.
3. Первичные функции генов. Генетический код и его свойства.
4. Уровни структурной организации наследственного материала: генный, хромосомный, геномный.
5. Генная система клеток про- и эукариот. Роль ядра и цитоплазмы в передаче наследственного материала.
Триплет является элементарной функциональной единицей гена, а пара нуклеотидов - его структурной единицей.
Различают следующие уровни структурно-функциональной организации наследственного материала: генный, хромосомный и геномный.
Элементарной структурой ГЕННОГО уровня организации служит ген. На этом уровне изучается структура молекулы ДНК, биосинтез белка и др. Благодаря относительной независимости генов возможно дискретное (раздельное) и независимое наследование (III закон Менделя) и изменение (мутации) отдельных признаков.
Гены клеток эукариот распределены по хромосомам, образуя ХРОМОСОМНЫЙ уровень организации наследственного материала. Этот уровень организации служит необходимым условием сцепления генов и перераспределения генов родителей у потомков при половом размножении (кроссинговер).
Вся совокупность генов организма в функциональном отношении ведет себя как целое и образует единую систему, называемую ГЕНОМОМ. Один и тот же ген в разных генотипах может проявлять себя по-разному. Геномный уровень организации объясняет взаимодействие генов как в одной, так и в разных хромосомах.
2. Понятие о гене. Структурная организация генов прокариот и эукариот. Классификация генов.
Геном прокариот
Основной чертой молекулярной организации прокариот является отсутствие в их клетках ядра, отгороженного ядерной мембраной от цитоплазмы. Отсутствие ядра является лишь внешним проявлением особой организации генома у прокариот.
Геном прокариот построен очень компактно. Количество некодирующих последовательностей нуклеотидов минимально. Многие механизмы регуляции экспрессии генов, использующиеся у эукариот, никогда не встречаются у прокариот. Простота строения генома прокариот объясняется их упрощенным жизненным циклом.
Ген - единица наследственной информации, занимающая определенное положение в геноме или хромосоме и контролирующая выполнение определенной функции в организме. По результатам исследования прокариот, главным образом Е. сoll, ген состоит из двух основных элементов: регуляторной части и собственно кодирующей части. Регуляторная часть гена обеспечивает первые этапы реализации генетической информации, заключенной в структурной части гена; структурная часть гена содержит информацию о структуре кодируемого данным геном полипептида. Количество некодирующих последовательностей в структурной части гена у прокариот минимально. 5"-конец прокариотического гена имеет характерную организацию регуляторных элементов, особенно на расстоянии 50 - 70 н.п. от точки инициации транскрипции. Этот участок гена называют промотором. Он важен для транскрипции гена, но сам в РНК не транскрибируется. Противоположный 3"-конец - терминаторная область, необходимая для тер-минации транскрипции. В РНК он также не транскрибируется. Транскрипция начинается со стартовой точки (+1).
Последовательности ДНК, являющиеся сигналами остановки транскрипции, находятся на 3"-конце гена и называются транскрипционными терминаторами. Они содержат последовательности, которые в транскрибируемой РНК формируют структуру шпильки.
Кроме хромосомы у большинства бактерий существуют другие способные к автономной репликации структуры - плазмиды. Это двуцепочечные кольцевые ДНК размером от 0,1 до 5% размера хромосомы, несущие гены, необязательные для клетки-хозяина, или гены, необходимые лишь в определенной среде. Именно такие внехромосомные элементы и содержат гены, которые придают клеткам наследуемую устойчивость к одному или нескольким антибиотикам. Они получили название факторов резистентности, или К-факторов. Другие плазмиды определяют болезнетворность патогенных бактерий, например патогенных штаммов Е. соli, возбудителей чумы и столбняка. Третьи - определяют способность почвенных бактерий использовать необычные источники углерода, например углеводороды нефти.
Геном эукариот
Для клеток эукариот характерно наличие оформленного ядра. Информационной макромолекулой их генома является ДНК, которая неравномерно распределена по нескольким хромосомам в виде комплексов с многочисленными белками. Однако генетическую информацию в клетках содержат не только хромосомы ядра. Жизненно важная генетическая информация заключена и во внехромосомных молекулах ДНК. У эукариот - это ДНК хлоропластов, митохондрий и других пластид. Под геномом эукариотического организма в настоящее время понимают суммарную ДНК гаплоидного набора хромосом и каждого из внехромосомных генетических элементов, содержащуюся в отдельной клетке зародышевой линии многоклеточного организма.
Геном эукариот существенно отличается от генома прокариот по ряду признаков, среди которых необходимо отметить его избыточность. Эукариотическая клетка содержит во много раз больше генов, чем прокариотическая. Повышенное содержание ДНК в геноме эукариот нельзя объяснить лишь увеличением потребности этих организмов в дополнительной генетической информации в связи с усложнением организации, поскольку большая часть их геномной ДНК, как правило, представлена некодирующими последовательностями нуклеотидов. Феномен значительной избыточности генома эукариот в отношении некодирующих последовательностей нуклеотидов известен под названием «парадокса С».
Эукариотический ген можно рассматривать как совокупность сегментов ДНК, которые вместе составляют экспрессируемую единицу, ответственную за образование специфического функционального продукта - либо молекулы РНК, либо полипептида.
К сегментам ДНК, составляющим ген, относятся следующие элементы:
Единица транскрипции – это участок ДНК, кодирующий
первичный транскрипт. Он включает: а) последовательность, которая обнаруживается в зрелых функциональных молекулах РНК; б) интроны (для мРНК); в) промежуточные последовательности - спейсеры (для рРНК). Интроны и спейсеры удаляются в
ходе процессинга первичных транскриптов; г) 5"- и 3"-нетранслируемые последовательности (5"-НТП и З"-НТП).
Минимальные последовательности, необходимые для начала
транскрипции (промотор) и конца транскрипции (терминатор).
Последовательности, регулирующие частоту инициации транскрипции, ответственные за индуцибельность и репрессию транскрипции, а также клеточную, тканевую и временную специфичность транскрипции. Они разнообразны по строению, положению и функциям. К их числу относятся энхансеры
и сайленсеры - это последовательности ДНК, расположенные в
тысячах пар нуклеотидов от промотора эукариотического гена и
оказывающие дистанционное влияние на его транскрипцию.
В отличие от прокариотических генов, почти всегда коллинеарных своим РНК, многие гены эукариот имеют мозаичное строение. Под мозаичностью в данном случае подразумевается чередование кодирующих (экзоны) и некодирующих (вставочные последовательности, или интроны) последовательностей в пределах единицы транскрипции. Интроны чаще всего встречаются в генах, кодирующих белки.
Существенную часть генома эукариот (10 - 30%) составляют повторяющиеся последовательности, имеющие определенную структурную организацию и способные перемещаться в геноме как в пределах одной хромосомы, так и между хромосомами. Они получили название подвижных генетических элементов.
Различают два основных класса подвижных генетических элементов: транспозоны и ретротранспозоны. Такая классификация основана на молекулярных механизмах, с помощью которых перемещаются эти элементы.
Классификация генов
Накопленные знания о структуре, функциях, характере взаимодействия, экспрессии, мутабильности и других свойствах генов породили несколько вариантов классификации генов.
По месту локализации генов в структурах клетки различают расположенные в хромосомах ядра, ядерные гены и цитоплазматические гены, локализация которых связана с хлоропластами и митохондриями.
По функциональному значению различают:структурные гены, характеризующиеся уникальными последовательностями нуклеотидов, кодирующих свои белковые продукты, которые можно идентифицировать с помощью мутаций, нарушающих функцию белка, и регуляторные гены - последовательности нуклеотидов, не кодирующие специфические белки, а осуществляющие регуляцию действия гена (ингибирование, повышение активности и др.).
По влиянию на физиологические процессы в клетке различают: летальные, условно летальные, супервитальные гены, гены-мутаторы, гены-антимутаторы и др.
Следует отметить, что любые биохимические и биологические процессы в организме находятся под генным контролем. Так, деление клеток (митоз, мейоз) контролируется несколькими десятками генов; группы генов осуществляют контроль восстановления генетических повреждений ДНК (репарация). Онкогены и гены - супрессоры опухолей участвуют в процессах нормального деления клеток. Индивидуальное развитие организма (онтогенез) контролируется многими сотнями генов. Мутации в генах приводят к измененному синтезу белковых продуктов и нарушению биохимических или физиологических процессов.
Гомеозисные мутации у дрозофилы позволили открыть существование генов, нормальной функцией которых является выбор или поддержание определенного пути эмбрионального развития, по которому следуют клетки. Каждый путь развития характеризуется экспрессией определенного набора генов, действие которых приводит к появлению конечного результата: глаза, голова грудь, брюшко, крыло, ноги и т. д. Исследования генов комплекса bithorax дрозофилы американским генетиком Льюисом показали, что это гигантский кластер тесно сцепленных генов, функция которых необходима для нормальной сегментации груди (thorax) и брюшка (abdomen). Подобные гены получили название гомеобоксных. Гомеобоксные гены расположены в ДНК группами и проявляют свое действие строго последовательно. Такие гены обнаружены и у млекопитающих, и они имеют высокую гомологию (сходство).
Практически любой ген несёт информацию о строении какой-либо РНК. Эта информация закодирована в определённой последовательности триплетов. Однако сам ген функционировать практически не может.
Необходим целый ряд дополнительных структур, зон или участков, которые не только включают и выключают работу гена, но и меняют интенсивность его работы в зависимости от нужд организма. К таким структурам относится множество разнообразных последовательностей ДНК, которые до настоящего времени не имеют общепризнанной классификации. Мы будем придерживаться наиболее простой (но далеко не полной) классификации. По ней дополнительные структуры подразделяются на два типа – регуляторные зоны и регуляторные гены. Регуляторные зоны это участки ДНК на которых не происходит синтез РНК, но которые служат местом связывания различных белков (или РНК). Эти последовательности часто называют регуляторными зонами, (или регуляторные области, элементы, структуры, участки и др.). На регуляторных генах транскрибируется какая-либо РНК. Эта РНК может не кодировать белок, а осаждаться на регуляторной зоне гена. Но может и нести информацию о каком-либо белеке, тогда с регуляторной зоной связывается кодируемый РНК белок.
Таким образом, в настоящее время большинство учёных приходит к мнению, что наименьшей функциональной областью в ДНК является совокупность состоящая из структурного гена, регуляторных зон и регуляторных генов.
Сам ген представляет в основном кодирующую часть ДНК. Сразу же оговоримся, что у разных генов регуляторные области различны не только по строению, величине и другим параметрам, но и отличаются по пространственному положению относительно гена (или генов), функцию которого они курируют. Понятно, что рассмотреть строение всех известных генов и их регуляторных областей со всеми индивидуальными особенностями в нашем пособии невозможно. Поэтому приведём структуру некого гипотетического гена и его регуляторных областей, обозначив у них те участки, которые наиболее часто встречаются.
Кроме того, мы рассмотрим строение не всех структурных генов, а тех, с которых транскрибируется иРНК, несущая информацию о структуре белка. Это важно помнить, т.к. строение других генов (с которых транскрибируются тРНК, рРНК или регуляторных генов несколько иное).
а. Строение оперона прокариот
Как мы отмечали раньше, для нормального функционирования гена необходимы регуляторные зоны. Регуляторных генов в этом разделе касаться не будем.
У прокариот регуляторные зоны «обслуживают» несколько генов. Эти гены вместе с регуляторными элементами носят название оперон. Таким образом, оперон состоит из двух функционально различных участков: (см. рис. 18, А).
Кодирующего участка, который содержит несколько структурных генов.
Регуляторной зоны, которая включает следующие участки:
а. Стартовый кодон – сайт (место) инициации транскрипции.
б. Терминатор – сайт конца транскрипции.
в. Лидирующую область.
г. Трейлерную область.
д. Промотор.
е. Оператор.
ж. Активатор
з. Спейсеры.
Все эти участки представлены на рисунке 18 (Б,В,Г).
Как отмечали выше третий элемент – регуляторные гены, которые непременно входят в состав наименьшего функционирующего участка, в этом разделе рассматриваться не будут.
Регуляторная зона Кодирующая область (Гены)
А 5’ 3’
Регуляторная зона Ст. 1 Ст. 2 Ст. 3
Б 5’ 3’
Сайт начала транскрипции Терминатор
В 5’ 3’
Лидерная последовательность Трейлерная последовательность.
Ак. Пр. Оп. К о д и р у ю щ а я о б л а с т ь
Г 5’ 3’
Рис. 18. Схема регуляторных и кодирующих элементов оперона прокариот. На рисунке от А до Г повышается детализация строения оперона, его регуляторной и кодирующей области. Ст.1,2,3 – структурные гены. Ак. – активатор, Пр. – промотор, Оп. – оператор.
Кодирующая область (собственно ген) начинается с сайта инициации (стартовый кодон) . С этого участка РНК-полимераза, проходя через структурный ген, начинает синтезировать РНК. Заканчивается кодирующая область участком, который называется терминатор (рис. 18, Б). Подходя к нему, РНК-полимераза заканчивает транскрипцию и сходит с нити ДНК. Терминирующая область у многих генов имеет различное строение. Отметим два из них.
Чаще всего в терминирующей области располагается один из бессмысленных кодонов (УАА, УАГ, УГА), не кодирующий ни одну аминокислоту. Обнаружив эту последовательность РНК-полимераза прекращает синтез РНК.
Сигналом к окончанию транскрипции могут быть определённые короткие последовательности ДНК (не бессмысленные кодоны), которые располагаются в зоне окончания синтеза РНК. К этим последовательностям прикрепляется белок, который и прекращает транскрипцию.
В последнее время обнаружили, что в зоне терминатора ДНК может формировать шпильки, которые и приводят к окончанию транскрипции.
Область, располагающаяся между сайтом инициации и терминации, транскрибируется как одна нить РНК и носит название единица транскрипции . У прокариот единица транскрипции, как правило, содержит последовательности, кодирующие не один, а несколько типов белков или РНК, т.е. содержит несколько структурных генов (рис. 18, Б). Все они имеют одну регуляторную область и контролируют синтез ферментов одного биохимического цикла (на рисунке они обозначены как Ст1, Ст2 Ст3).
Кроме перечисленных регуляторных зон обнаружено, что перед стартовым кодоном и терминатором располагаются небольшие участки ДНК, которые соответственно носят название лидерные и трейлерные области (или последовательности). Лидерная область включает или отключает транскрипцию иРНК, трейлерная принимает участие в «созревании» иРНК (рис. 18,В).
Особенностью лидерного участка является то, что он транскрибируется, т.е представлен в молекуле иРНК. Но этот участок в рибосомах не транслируется, т.е. он не представлен аминокислотной последовательностью в белке. Более тщательные исследования показали, что лидерная последовательность обладает уникальной способностью приобретать форму шпильки в том случае, когда транскрипция данного гена клетке не нужна. Например, при отсутствии субстрата, нет необходимости транскрибировать иРНК и транслировать с неё фермент, расщепляющий субстрат. Поэтому довольно часто отсутствие субстрата провоцирует образование в лидерной последовательности шпильки и синтез иРНК не начинается.
Трейлерная последовательность транскрибируется на иРНК и является сигналом для формированию поли(А) хвостика при «созревании» про-иРНК (см. далее).
Начиная с 5’ конца, по направлению к 3’ концу располагаются – активатор, промотор и оператор (рис. 18, Г). К промотору присоединяется РНК-полимераза. Активатор и оператор регулируют активность гена. Так к активатору присоединяется белок, способный облегчить присоединение фермента к промотору или, наоборот, затормозить этот процесс. На операторе также осаждается белок, который может блокировать работу РНК-полимеразы.
Ещё раз подчеркнём важную особенность функционирования оперона у прокариот:- одна регуляторная область оперона (куда входят активатор, промотор, оператор, стартовый кодон и др.), как правило, обслуживает несколько структурных гена. Причём, между последними располагаются последовательности ДНК не несущие никакой информации. Эти последовательности называют спейсерами (см. рис. 19).
РО Ст.1 Ст.2 Ст.3 Ст.4
С п е й с е р ы Терминатор
Рис. 19 Кодирующая область оперона, включает 4 структурных гена (Ст.1,Ст2, Ст3, Ст4), которые разделены спейсерами. Обслуживаются они одной регуляторной областью (на рисунке она обозначена как РО).
Несколько слов о правилах обозначения генов. В разделе 1 мы уже объяснили, на каком принципе основано обозначение концов ДНК, если последняя представлена на графике в виде линейного изображения.
На рисунке 18 изображена одна нить ДНК, которая маркирована цифрами 5’(начало отрезка) и 3’(конец отрезка). Эти обозначения общеприняты и облегчают понимание генетических процессов происходящих на гене (транскрипции и трансляции), которые имеют выраженную направленность. Однако в обозначении направленности гена имеются некоторые особенности, без знания которых определить начало и конец отрезка ДНК сложно. Из школьного курса известно, что транскрипция РНК происходит на двухнитчатой ДНК только с одной её нити.
Эта нить ДНК называется матричной (этот термин употребляется чаще всего), антисмысловой, незначащей, не кодирующей, кодогенной и т.д. Понятно, что синтезированная с этой нити РНК будет комплементарна ей. Однако полное совпадение последовательностей нуклеотидов у вновь синтезированной РНК будет не с нуклеотидами матричной цепи, а с противоположной (второй, оппозитной) нитью ДНК, которая называется смысловая , не матричная, значащая, кодирующая, не кодогенная и т.д.
Транскрипция с матричной цепочки ДНК идёт в направлении от 3’ конца к 5’. Понятно, что противоположная цепочка ДНК будет иметь направление 5’ – 3’. Это направление и принято обозначать на рисунках. Поэтому необходимо помнить, что на рисунках принято обозначать цифрами не ту цепочку ДНК, с которой синтезируется (транскрибируется) РНК, а противоположную – смысловую (см. рис. 20).
5’ А Т А Т Г Ц А Т Г Ц 3’ Смысловая нить
А ДНК
3’ Т А Т А Ц Г Т А Ц Г 5’ Антисмысло-
вая нить ДНК, с
которой синтези-
руется иРНК
Б РНК 5’ А Т А Т Г Ц А Т Г Ц 3’ РНК синтезирован-
ная с антисмысло-
вой нити ДНК
В ДНК 5’ А Т А Т Г Ц А Т Г Ц 3’Так на рисунках обо-
значается отрезок,
ДНК. Последователь-
ность нуклелтидов-
в ней аналогична по-
следоватнельности
их в иРНК и антисмы
словой цепи ДНК.
Рис. 20. Схема транскрипции и правила обозначения направленности ДНК. А – отрезок молекулы ДНК, Б – синтезированная РНК на атисмысловой нити, В – цепь ДНК на рисунке обозначена так же, как и смысловая цепь ДНК
б. Строение функционирующего гена эукариот.
В общих чертах строение гена про- и эукариот в принципе одинаково. Ген эукариот так же как и у прокариот функционирует только совместно с регуляторными зонами. Но такой тандем у эукариот не называется опероном. Ген эукариот представляет собой в основном кодирующую часть ДНК, а регуляторные зоны – не кодирующую ДНК. Также как и у прокариот, рассмотрим не только строение самого гена – кодирующей его части, но и обслуживающие его элементы – регуляторные зоны.
Ген (кодирующая часть) состоит из:
а. Экзонов.
б. Интронов.
Регуляторные участки гена содержат:
а. Стартовый кодон – сайт (место) начала транскрипции.
б. Терминатор – сайт окончания транскрипции.
в. Лидерную последовательность.
г. Трейлерную последовательность.
д. Промотор.
е. Контролирующие зоны располагаются вблизи от обслуживаемого гена.
ж. Модуляторы (энхансеры, сайленсеры) – располагаются вдали от гена.
Некоторые исследователи объединяют контролирующую зону и модуляторы в одну область – регуляторную область.
Кодирующая часть гена эукариот имеет несколько существенных отличий от аналогичной области прокариот (рис. 22). Отметим два из них.
1. Как правило, кодирующая область представлена не несколькими генами, а одним. Каждый ген у эукариот имеет свою регуляторную область .
2. Если в генах прокариот не кодирующие участки практически отсутствуют, то ген эукариот имеет мозаичное строение – в нём чередуются участки, несущие информацию о последовательности аминокислот в белке и не несущие её. Участки, несущие информацию носят название экзоны, не несущие называются интроны . Число интронов у различных организмов различно.
Мозаичное строение чаше всего встречается в генах, кодирующих белки (с этих генов транскрибируется иРНК) и тРНК. Интересно, что сходные гены у разных организмов одного вида часто имеют одинаковое число интронов в одних и тех же позициях. Обычно длина интронов превышает длину экзонов.
Кодирующая часть гена представляет единицу транскрипции.
Что касается регуляции, то необходимо пояснить, что существуют два термина – регуляторные области (зоны, участки и т.д.) и регуляторные гены (гены-регуляторы).
Регуляторные области – э то участки ДНК на которых осаждаются белки-регуляторы. Их функция – регуляция транскрипции. Для простоты эти зоны подразделяют на два типа. Мы их отметили выше, но всё же повторим.
а. Зоны располагающиеся близко от гена, который они контролируют - контролирующие зоны.
б. Зоны располагающиеся далеко от контролируемого гена - модуляторы.
Гены-регуляторы – это обычные структурные гены, кодирующие иРНК несущую информацию о строении какого-либо белка-регулятора . Некоторые из этих генов транскрибируют специальные регуляторные РНК.
Рассмотрим строение регуляторных областей. Их несколько. На 5’- конце гена располагается сайт начала транскрипции. На 3’- конце располагается сайт окончания транскрипции (терминатор). Перед сайтом начала транскрипции, также как и у прокариот, располагается лидерная последовательность, а перед сайтом окончания транскрипции находится трейлерная последовательность. Функциональное значение этих участков аналогично таким же участкам у прокариот (см. выше). Если у прокариот транскрипцию всех генов осуществляла один фермент РНК- полимераза, то у эукариот существуют три типа РНК-полимераз, которые обеспечивают транскрипцию разных эукариотических генов (генов транскрибирующих иРНК, тРНК и рРНК). У большинства генов эукариот, как и у прокариот, эти ферменты связываются с участком,
э и э и э и э
Трейлерная последовательность
Лидерная последовательность
Сайт конца транскрипции
Сайт начала транскрипции
Рис. 21. Схема кодирующей области гена эукариот (э – экзоны, и – интроны) .
расположенным на 5’- конце ДНК перед сайтом инициации. Этот участок носит название промотор . Однако, в отличии от прокариот одна РНК-полимераза соединиться с промотором не способна. Прежде чем связаться с промотором РНК-полимераза эукариот соединяется с многочисленными белками (их около 50), которые способствуют её прикреплению к промотору. Эти белки называются факторами транскрипции , а образовавшийся комплекс РНК-полимеразы с факторами транскрипции именуется комплекс транскрипции (или транскрипционный комплекс) . Факторы транскрипции (их так же можно назвать регуляторными белками) активируют РНК-полимеразу и кодируются регуляторными генами.
Образование комплекса транскрипции и его активность в свою очередь контролируют ещё два типа белков-регуляторов. Первый тип белков осаждается на регуляторные (зоны) последовательности ДНК, которые располагаются, как правило, рядом с промотором. Эти белки ускоряют или тормозят образование транскрипционного комплекса. Регуляторные последовательности имеют различные названия. Чаще всего их объединяют термином – контролирующие зоны или цис-регуляторные элементы. К этой зоне относится лидерная последовательность , промотор и регуляторные зоны. располагающиеся рядом с промотором - рядом расположенные области (рис. 24). К контролирующим зонам присоединяются различные регуляторные белки, которые влияют на начальное связывание РНК-полимеразы с промотором. Эти белки носят специальное название – факторы транскрипции .
Второй тип регуляторных последовательностей усиливает или тормозит движение транскрипционного комплекса по гену. У эукариот эти участки часто расположены далеко от контролируемого ими гена: - впереди от 5’- конца кодирующей области, но за несколько тысяч пар нуклеотидов от кодирующего участка, в самой кодирующей области или позади неё. В некоторых случаях их выявляют на других хромосомах (рис.23 А,Б,В,Г).
Рядом располагающиеся контролирующие зоны
Лидирующая область
Промотор Кодирующая область
Модуляторы Сайт инициации
ОРГАНИЗАЦИЯ ГЕНОМА ПРОКАРИОТ
Геном прокариот может состоять из одной или нескольких крупных молекул ДНК, называемых хромосомами, и небольших молекул ДНК – плазмид. В хромосомах представлены практически все гены, необходимые для жизнедеятельности бактерии. Плазмиды же несут гены, необязательные для бактерии, без них клетка может обойтись, хотя в некоторых условиях они способствуют ее
выживанию.
Хромосомы и плазмиды могут представлять собой как кольцевые, так и линейные двухцепочечные молекулы ДНК. Геном бактерий может состоять из одной или нескольких хромосом и плазмид. Хромосома(ы) в бактериальной клетке пред-ставлена(ы) в виде одной копии, т.е. бактерии гаплоидны. Плазмиды же могут присутствовать в клетке как в виде одной копии, так и в нескольких.
Хромосома уложена в компактную структуру – нуклеоид, который имеет овальную или сходную с ней форму. Его структура поддерживается ДНК-связывающими гистоноподобными белками и молекулами РНК. С нуклеоидом также ассоциированы молекулы РНК-полимеразы и ДНК-топоизомеразы I. По периферии нуклеоида располагаются петли хромосомной ДНК, которые находятся в транскрипции в активном состоянии. При подавлении транскрипции эти петли втягиваются внутрь. Нуклеоид не является стабильным образованием и во время различных фаз роста бактериальных клеток изменяет свою форму. Изменение его пространстве ой организации сопряжено с изменением транскрипционной активностью определенных генов бактерий.
В состав хромосомы могут входить геномы умеренных фагов. Включение их геномов в клеточный может происходить после заражения фагами бактерий. При этом одни фаговые геномы интегрируют в строго определенные участки хромосомы, другие – в участки различной локализации.
Размер геномов прокариот колеблется от нескольких сотен тысяч до десятка миллионов пар нуклетидов.
Геномы прокариот отличаются друг от друга по содержание ГЦ-пар, их доля в их составе колеблется от 23 до 72 %. Интересно, что в ДНК бактерий, обитающих при высоких температурах, содержание этих нуклеотидов повышено. Их преобладание над АТ-парами обуславливает более высокую температуру плавления ДНК, что является жизненно необходимым фактором для таких бактерий. Нужно
отметить, что в белках термофильных бактерий повышено также и содержание полярных аминокислот, что делает их более устойчивыми к денатурации при повышенных температурах. В составе белков хеликобактерий (обитающих в кислой среде) больше аминокислотных остатков аргинина и лизина. Остатки этих аминокислот способны связывать ионы водорода, тем самым, оказывая влияние на кислотность среды, и способствуя выживанию бактерий в сложных экологических условиях.
О числе генов в геноме судят по наличию в их составе открытых рамок считывания (ОРС). ОРС представляет собой полинуклеотидную последовательность, потенциально способную кодировать полипептид. О существовании ОРС на тех или иных участках ДНК судят на основании расшифрованной первичной структуры ДНК.
Основным критерием принадлежности участка полинуклеотидной цепи к ОРС служит отсутствие стоп-кодонов на достаточно протяженном участке после стартового кодона. В то же время наличие ОРС является недостаточным условием для утверждения о наличии на данном участке ДНК гена.
Гены, прокариот, как правило, имеют оперонную организацию. В одном опероне обычно представлены гены, ответственные за осуществление одного и того же метаболического процесса.
ОРГАНИЗАЦИЯ ГЕНОМА ЭУКАРИОТ
Хранителем генетической информации у эукариот так же как и у прокариот, является двухцепочечная молекула ДНК. Основная часть генетической информации у них сосредоточена в клеточном ядре в составе хромосом, значительно меньшая часть представлена в составе ДНК митохондрий, хлоропластов и других пластид.
Геномная ДНК эукариот представляет собой совокупность ДНК гаплоидного набора хромосом и внехромосомной ДНК, представленные в клетке зародышевой линии. Общее содержание ДНК, приходящиеся на один гаплоидный набор, носит название величина С. Ее выражают в пг ДНК, дальтонах или в парах нуклеотидов (1 пг = 6,1 10 11 Да = 0,965 10 п.н.). Значение величины С, как правило, возрастает с увеличением организации живых ор- ганизмов. Однако, у некоторых родственных видов величины С могут значительно отличаться, в то время как морфоло-гия и физиология этих видов отличаются друг от друга несущественно.
Каково же значение негенной ДНК? Существуют несколько гипотез, объясняющих ее роль. Одной из таковой является предположение, что некодирующие последовательности генома эукариот способствуют защите генов от химических мутагенов.
Ядерная ДНК эукариот состоит из уникальных и повторяющихся последовательностей. Повторяющаяся ДНК в свою очередь может быть разделена на две фракции: умеренно повторяющаяся и часто повторяющаяся ДНК:
К часто повторяющейся принадлежит ДНК, представленная в геноме более 105 копий. К этой фракции относится сателлитная ДНК.
Содержание сателлитной ДНК составляет в геноме эукариот от 5 до 50 % от всей ДНК. Эта ДНК преимуществе о обнаруживается в центромерных и теломерных рай- онах хромосом, где она выполняет структурные функции. Сателитная ДНК состоит из тандемных повторов длиной от 1 до 20 и более п.н. Благодаря простоте организации и многочисленным копиям эта ДНК обладает способностью к быстрой ренатурации.
В геноме эукариот различают микросателлиты, минисателлиты и макросателлиты. Микросателлиты образованы многократно повторяющимися мономерными звеньями (1 – 4 п.н) и имеют размер до нескольких сотен пар нуклеотидов. Они разбросаны по геному, их длина и общее количество копий коррелирует с размером генома. Количество копий микросателлитов в геноме может достигать десятков и сотен тысяч.
Макросателлиты обладают в сравнении с микросателлитами и минисателлитами большим размером повторяющегося звена до 1000 и более пар нуклеотидов. Они обнаружены в геномах птиц, кошек и человека.
Умеренно повторяющиеся последовательности в геноме представлены до 104 копий. К ним относятся генные семейства и МГЭ.Генные семейства образуют гены, обладающие гомологичной (или идентичной) нуклеотидной последовательностью, и выполняющие одну и ту же или сходные функции. Они могут быть организованы в виде кластеров или же разбросаны по геному. Существование генов в большом числе копий обеспечивает повышенное образование продуктов их экспрессии. Семейства образуют гены гистонов, рРНК, тРНК и др. МГЭ эукариот составляют в среднем около 10 – 30 % генома. Они могут концентрироваться в определенных участках хромосомы или быть рассеянными по геному
К уникальной ДНК относятся неповторяющиеся нуклеотидные последовательности. Ее содержание у различных видов варьирует от 15 до 98 %. Доля уникальных последовательностей ДНК у низших эукариот значительно выше, чем у высших. К уникальной ДНК относятся как кодирующие, так и не кодирующие последовательности. При этом большая часть уникальной ДНК не несет функции кодирования. К некодирующей уникальной ДНК относятся интроны, к кодирующей – экзоны.
Строение м-РНК
Информационная (матричная) РНК (иРНК, мРНК; messenger RNA, mRNA): однонитевая РНК, содержащая информацию об аминокислотных последовательностях белка.
мРНК содержится в ядре и цитоплазме. Функция ее состоит в переносе информации о структуре белка от ДНК к месту синтеза белка в рибосомах. На долю м-РНК приходится примерно 0,5-1% от общего содержания РНК клетки.
Зрелая мРНК эукариот наряду с основной последовательностью нуклеотидов, в которой закодирована информация о последовательности аминокислот в соответствующем белке, содержит целый ряд некодирующих последовательностей, необходимых для ее трансляции рибосомами. Часть этих последовательностей, такие как кэп-группа и 3"-концевая поли(А), не кодируются непосредственно генами, а добавляются ко- и посттранскрипционно, другие имеют генное происхождение. Эти последовательности часто содержат регуляторные сигналы, обеспечивающие определенный уровень трансляции мРНК рибосомами.
Участок мРНК, расположенный между кэп-группой и первым инициирующим кодоном основнойоткрытой рамки считывания (ОРС) , которая и несет информацию о последовательности аминокислот в белке, получил название 5"-концевой нетранслируемой области (5"UTR - 5" untranslated region), илилидерной последовательности. Сегмент мРНК, расположенный между последним терминирующим кодоном основной ОРС и началом поли(А)- последовательности, называют 3"-концевой нетранслируемой областью (трейлером) - (3"UTR) . Первое название не совсем удачно: последовательности 5"UTR, как правило, способны образовывать сложные вторичные структуры типа "стебель-петля" и содержать короткие ОРС (uORF - upstream open reading frame) , которые оказывают сильное влияние на эффективность трансляции мРНК.
Помимо этого, 5"UTR могут включать в себя регуляторные последовательности, распознаваемые транс-действующими белковыми факторами. Последовательности 5"UTR обеспечивают регулируемую трансляцию мРНК (и координированную экспрессию соответствующих генов) в онтогенезе многоклеточных организмов.
3"UTR и поли(А)-последовательность оказывают влияние на состояние рибосом после терминации синтеза полипептидных цепей. Кроме того, 3"-концевая поли(А)-последовательность участвует в инициации трансляции.
31)ПРОЦЕССИНГ РНК
Процессингу подвергаются различные виды РНК: иРНК, рРНК, тРНК и др. Наиболее ярко постранскрипционные модификации РНК выражены у эукариот. У прокариот процессинг РНК необходим при образовании зрелых молекул рРНК и тРНК.
ПРОЦЕССИНГ иРНК
В процессе созревания иРНК эукариот происходит образование на 5’-конце кэпа, удаление интронов, синтез на 3’-конце полиА-последовательности. В отличие от эукариот иРНК только в единичных случаях подвержены процессингу. Эукариоты Созревание иРНК происходит в ядре эукариотических клеток. Этот процесс начинается, как правило, уже в ходе транскрипции. К 5’-концу иРНК присоединяется кэп. На 3’-конце иРНК по окончании транскрипции образуется полиА-последовательность, сигналом для полиаденилирования служит последовательность AAUAAA, расположенная за 11 – 30 нуклеотидов до сайта полиаденилирования. иРНК эукариот также подвергаются сплайсингу. Зрелая иРНК транс-портируется из ядра в цитоплазму клетки, где она служит матрицей для синтеза белка Рис.5.18. Процессинг иРНК эукариот
Следует отметить, что некоторые иРНК экариот не имеют полиА-последовательностей, и что некоторые предшественники иРНК не содержат интронов. Естественно, что они неподвергаются сплайсингу. Процессинг иРНК прокариот иРНК прокариот, как правило, процессингу не подвергается, потому что процессы транскрипции итрансляции у них сопряжены. Еще до завершения транскрипции с иРНК, синтезируемой РНКполимеразой, взаимодействуют рибосомы, которые и начинают син-тез полипептидных цепей Некоторые полицистронные иРНК прокариот могут расщеп-ляться с образованием индивидуальных иРНК. В одних случаях такое расщепление необходимо для успешной трансляции, в других не является обязательным. В некоторых случаях 3’-конец иРНК прокариот подвергается посттранскрипционному полиаденилированию, размер поли А-последовательностей составляет 14 – 60 нуклеотидов. Некоторые пре-иРНК прокариот содержат интроны.
ПРОЦЕССИНГ тРНК
Почти все тРНК синтезируются в виде предшественников – более длинных молекул (пре-тРНК). В результате процессинга происходит удаление нуклеотидных последовательностей с флангов пре-тРНК. С 5’-конца фрагмент нуклеотидной цепи отщепляет фермент, называемой РНК-азой. РНКазой являетсярибонуклеопротеином,каталитическую функцию в котором осуществляет РНК-компонент, белок же выполняет структурную роль. В бактериальной РНКазе есть участок, комплементарный ЦЦА участку тРНК. Эукариотическая РНКаза P узнает другие элементы предшественника тРНК. С 3’-конца пре-тРНК действует экзонуклеаза, укорачивающая РНК постепенно, удаляя по одному нуклеотиду. На заключительных ста-диях созревания тРНК к 3’-концу полинуклеотидилтрансфераза присоединяет последовательность ЦЦА (рис. 5.20). Общая схема процессинга тРНК. У прокариот ЦЦA-последовательность может быть закодиро-вана в генах тРНК, тогда в созревании пре-тРНК, считанных с таких генов, полинуклеотидилтрансфераза может не участвовать. Однако в некоторых случаях ЦЦА-последовательность может быть удалена экзонуклеазой в процессе созревания тРНК, тогда для ее восстановления необходимо участие нуклеотидилтрансферазы. У эукариот ЦЦA-последовательность не кодируется в генах тРНК , она добавляется посттранскрипционно. У прокариот первичный транскрипт может содержать несколько последовательностей тРНК, их процессинг включает вырезание
индивидуальных молекул тРНК. В процессе созревания тРНК также происходит модификация азотистых оснований – в результате которой образуются минорные основания: псевдоуридин, дигидроуридин, тимидин, 7-метил-гуанозин, инозин и др. Сплайсинг пре-тРНК В процессе сплайсинга нуклеаза вырезает интрон, а лигаза обеспечивает сшивание двух фрагментов тРНК за счет образования фосфодиэфирной связи, в результате обра-зуется ковалентно замкнутая молекула тРНК (рис. 5.22). ПРОЦЕССИНГ рРНК Поцессинг необходим для созревания как прокариотических рРНК, так и эукариотических.
Геном эукариот более сложен, чем у прокариот и включает нуклеотидные последовательности хромосом, ДНК митохондрий и пластид (1-10 % от общего генома, у дрожжей до 20%), ДНК плазмид у дрожжей, ДНК латентных и дефектных вирусов.
Ядро эукариот хорошо выражено, имеется ядерная мембрана, окружающая хромосомы. Хромосом много, они парные, состоят из гомологичных хроматид, каждая из которых представляет двухцепочечную молекулу ДНК (набор хромосом диплоидный ). В составе хромосомы – 50 % ДНК и 50 % белков, которые представлены основными гистоновыми белками , входящими в состав нуклеосом, и кислыми белками , которые заполняют полость нуклеосом, разрыхляют ее и играют важную роль в распаде нуклеосом перед началом транскрипции и репликации.
В релаксированном состоянии хромосомы эукариот могут достигать нескольких сантиметров (у человека до 5 см в длину). Существуют несколько стадий конденсации хромосом, в результате чего хромосома компактизируется, накручивается на нуклеосомы и образует более сложные свернутые структуры.
Стадии компактизации (конденсации) хромосом . Акты конденсации и деконденсации хромосом сменяют друг друга в клеточном цикле: в интерфазе ДНК выглядит в виде вытянутых спутанных нитей и получила название - хроматин . В этом состоянии ДНК частично релаксирована, что облегчает прохождение процесса транскрипции и репликации. Для расхождения (сегрегации ) хромосом в митозе очень важно, чтобы хромосомы были суперспирализованы – конденсированы. Для этого в начале профазы митоза ДНК начинает компактизоваться с помощью положительной и отрицательной суперспирализации, а также путем накручивания на нуклеосомы. Нуклеосомная нить ДНК напоминает бусы, в которых нить (суперспирализованная молекула ДНК) намотана на бусинки (нуклеосомы).
Рис. 3.1. Cтадии компактизации хроматина
Нуклеосома – октомер из 8 субъединиц белков-гистонов, включающая по 2 молекулы гистонов Н2А, Н2В, Н3, Н4. Диаметр нуклеосомы - 11 нм, высота - 5,7 нм. По краям от нуклеосом имеются свободные участки ДНК в 20-90 пар нуклеотидов – линкеры . Гистон Н1 не входит в состав нуклеосомы, а фиксирует петли линкеров, удерживая ДНК на нуклеосоме. Такое нуклеосомное строение хромосом характерно только для линейных хромосом эукариот.
В результате спирализации и накручивания на нуклеосомы хромосомы укорачиваются и превращаются в метафазные хромосомы (стадия метафазы), сокращаясь в длину в 10000 раз, а в диаметре – примерно в 700 раз. Это способствует нормальному расхождению (сегрегации) хромосом в анафазе митоза. Рентгеноструктурный анализ позволил выявить следующие стадии компактизации ДНК.
1-ая стадия - двухцепочечная спираль ДНК (диаметр – 2 нм), обычно в правозакрученной В-форме.
2-ая стадия – нуклеосомная нить (диаметр – 11нм). ДНК наматывается на частички нуклеосом, образуя на них 1,75 витка (146 пар нуклеотидов).
3-ая стадия – образование хроматиновой фибриллы (диаметр 30 нм). Нуклеосомы сближаются друг с другом, образуется зигзагообразная «лента», которая скручивается в соленоид – спираль с полостью внутри.
4-ая стадия – образование петлевых доменов (диаметр 300 нм) формируется путем формирования петель из нити соленоида.
5-ая стадия – образование метафазных хромосом, которые получили название «ламповых щеток» (диаметр 1400 нм).
Избыточность геномов эукариот. Только незначительная часть ДНК у эукариот представлена структурными и регуляторными генами, остальная часть генома представляет собой «эгоистичную» (сателлитную) ДНК, которая очевидно попала в геном эукариот путём интеграции вирусов и других мобильных генетических элементов. В геноме человека насчитывается 3,5 х 10 9 пар нуклеотидов. Геномы млекопитающих различаются, но имеют близкие значения молекулярной массы хромосом, достигающие сотен миллиардов Да. В соответствии с величиной генома у человека должно бы было быть 150000 и более генов, однако в 2003 г. американские ученые заявили о существовании 30000 генов, в последние годы предполагается наличие 75 тыс. генов, остальная часть геномной ДНК очевидно является “генетическим мусором”. Значительная часть генома представлена некодирующими последовательностями. У человека некодирующие последовательности составляют 80-85% (по другим данным – 92%), а у растений – до 90% и более, т.е. характерна избыточность генома .
В геноме эукариот выделяют следующие типы последовательностей ДНК :
1)многократно повторяющиеся последовательности, которых насчитывается более 10 5 повторов на геном. Чаще всего это блоки из 5-8 нуклеотидов, которые тандемно повторяются и образуют фрагменты в 150-500 пар нуклеотидов, например - (ААТАТ)30-100. Функция их до конца неизвестна, но предполагают, что они могут играть роль в регуляции работы генов – находятся в области центромер, теломер, интронов, транспозонов. Это последовательности: Alu, B1 , B2, L1. Среди многократно повторяющихся последовательностей очень часто встречаются сайты рестрикции в составе палиндромов (см. дальше - тема «Репарации»). Сайты рестрикции могут быть теми горячими точками, куда встраиваются плазмиды, транспозоны, вирусные ДНК, трансгены.
2) умеренно повторяющиеся последовательности – встречаются на геном от 10 до10 5 . К ним относятся последовательности, кодирующие гистоны, рибосомальные белки, р-РНК и т-РНК, IS-элементы, вставочные последовательности.
3) мультигенные семейства – это группы близких по структуре и функциям генов, которые «включаются» на разных этапах онтогенеза. Например b-цепь гемоглобина кодируется 7 генами, 2 из которых дефектные (псевдогены), остальные 5 включаются последовательно на разных этапах развития: в раннем эмбриогенезе, в плодном периоде (8-9 недель), в детском, юношеском и зрелом возрасте.
4) уникальные гены - специфические гены, которые кодируют синтез структурных и ферментных белков.
Структура генов эукариот. Гены эукариот имеют регуляторные элементы подобные прокариотам - промоторную и терминаторную зоны, между которыми располагается последовательность ДНК, непосредственно кодирующая белок. Регуляторные элементы генов очень важны, поскольку именно благодаря им гены «включаются» только тогда, когда есть необходимость в соответствующих белковых продуктах. Промоторная зона обеспечивает начало транскрипции и трансляции, а терминаторная зона – конец этих процессов.
В промоторах можна выделить следующие консервативные последовательности: ГЦ-мотив, ЦААТ, ТАТА, АГГАГ, инициирующий кодон АТГ (АУГ на РНК). Далее идет структурная часть гена, которая состоит из экзонов и интронов. За структурной частью гена следует зона терминатора, представленная терминирующим кодоном ТТА (ТАГ или ТГА) и терминатором. На рис. 3.1. представлены основные участки гена эукариот.
Рис. 3.2. Тонкая структура гена эукариот
Обозначения и пояснения к рис. 3.2.
Функции основных регуляторных элементов гена
· ГЦ-мотив – один из наиболее часто встречающихся регуляторных элементов гена. Представлен палиндромом ГГЦГГГ / ЦЦЦГЦЦ , встречается в генах общих функций, то есть тех, которые экспрессируются во всех клетках организма и играют важную роль в их жизнеобеспечении. Этот участок является, очевидно, оператором транскрипции. Присоединение к ГЦ-мотиву белка-регулятора SP1, увеличивает транскрипцию в 10-20 раз.
· ЦААТ – участок промотора гена, который, по всей видимости, распознается РНК- полимеразой перед началом транскрипции. Очевидно, этот участок выполняет ту же функцию, что у прокариот ТТГАЦА (блок Гилберта) . ЦЦААТ встречается в тканеспецифичных генах, то есть тех, которые экспрессируются только в некоторых тканях и органах. Так, ген инсулина включается в основном только в клетках островков Лангерганса поджелудочной железы, ген альфа-фетопротеина - у взрослого человека только в клетках печени.
· блок Хогнеса - ТАТА (ТАТАААА или ТАТААТА) , подобен блоку Прибнова (ТАТААТ) у прокариот, служит для присоединения РНК-полимеразы к ДНК в промоторной зоне, его положение в гене относительно нулевой точки начала транскрипции – (-30).
· центр связывания с рибосомой содержит редуцированную последовательность Шайна-Дальгарно АГГАГ (см. функции последовательности Шайна-Дальгарно АГГАГГ у прокариот, тема «Геномы прокариот»).
· инициирующий кодон представлен триплетом АТГ (АУГ – на РНК), транскрибируется в составе информационной РНК, с него начинается трансляция. При синтезе полипептида на рибосоме этому кодону соответствует аминокислота метионин. С метионина начинается синтез большинства белков.
· структурная часть гена – это последовательность ДНК, которая непосредственно кодирует сам белок. У эукариот, в отличие от прокариот, она не цельная, а состоит из экзонов (кодирующих участков) и интронов (вставочных некодирующих участков).
· терминирующий кодон - участок, который транскрибируется на и-РНК и обеспечивает окончание трансляции на рибосомах. На ДНК представлен нонсенс-кодонами - триплетами ТАА, ТАГ, ТГА, на РНК им соответствуют УАА, УАГ и УГА. Этим триплетам не соответствует ни одна из аминокислот, поэтому на них в рибосоме обрывается синтез полипептида.
· терминаторный участок очевидно представлен в каждом гене специфической нуклеотидной последовательностью.
В геноме эукариот обнаружили также специфические регуляторные последовательности, которые могут выступать в роли энхансеров – усилителей транскрипции, а также последовательности, которые выступают в роли сайленсеров – глушителей транскрипции. Они могут находиться на значительном удалении от гена, который регулируют, причем, одни и те же последовательности в одной клетке могут быть энхансерами, а в другой - сайленсерами. С их помощью регулируется экспрессия генов.
Обнаружены также регуляторные белки, способные связываться с промоторной зоной гена и обеспечивающие либо активацию, либо подавление транскрипции. Так, регуляторный белок SP1, связываясь с ГЦ-мотивом, может усиливать транскрипцию в 10-20 раз.
Устройство генов эукариот. Гены эукариотических организмов обладают следующими характеристиками:
Одиночные, т.е. в отличие от прокариот, не собраны в опероны;
Иногда олигомерные (представлены генами-кластерами);
Прерывистые, т.е. разделены на интроны и экзоны;
Перекрывающиеся, т.е. в пределах одного генного участка ДНК может функционировать несколько рамок считывания.
Генетический анализ у эукариот, в частности у их простейших представителей – дрожжей и нейроспоры, показал, что гены, контролирующие различные этапы одного и того же пути метаболизма, как правило, хаотично разбросаны по геному и обычно не образуют скоплений подобно оперонам бактерий. Однако было найдено несколько исключений, а именно: компактный участок ДНК у грибов контролирует 3 реакции в биосинтезе гистидина. Сходная ситуация обнаружена при изучении генетического контроля биосинтеза ароматических аминокислот (триптофана, тирозина, фенилаланина), а также – жирных кислот. У исследователей создалось впечатление, что они имеют дело с опероноподобной структурой, кодирующей мультиэнзимный комплекс. В действительности же оказалось (при использовании мутационного анализа), что у грибов все 5 этапов биосинтеза ароматических аминокислот контролирует 1 ген, продуктом которого является длинная полипептидная цепь массой 150 000 Д. Это не оперон, а ген-кластер (cluster-gene) . Такие гены-кластеры довольно часто встречаются у эукариот. В качестве примеров можно привести следующие гены-кластеры:
· his 4 – ген-кластер для биосинтеза гистидина у дрожжей-сахаромицетов, кодирует единый полипептид с тремя ферментативными активностями;
· arom 1 – ген-кластер для биосинтеза ароматических аминокислот у нейроспоры, кодирует единый полипептид с пятью ферментативными активностями;
· fas 1 – первый ген-кластер для биосинтеза жирных кислот у дрожжей-сахаромицетов, кодирует полипептид с тремя ферментативными активностями
· fas 2 – второй ген-кластер для биосинтеза жирных кислот у дрожжей-сахаромицетов, кодирует единый полипептид с пятью ферментативными активностями.
Существование генов-кластеров является примером молекулярной олигомеризации . Очевидно, считывание с гена-кластера информации сразу о нескольких ферментах метаболического пути является для клетки “экономически” более выгодным, как и в оперонах прокариот. В отличие от оперона бактерий, в генах-кластерах в результате транскрипци и последующей трансляции на рибосомах синтезируется одна длинная молекула полипептида, в которой отдельные домены после пространственной укладки в третичную структуру начинают выполнять функции отдельных ферментов. В оперонах прокариот отдельные гены оперона обычно транслируются в самостоятельные белковые продукты.
Большинство же генов эукариот – одиночные, т. е в ходе эволюции эукариот происходила автономизация генов. По-видимому, это создает благоприятные условия для раздельной, а значит, и более тонкой регуляции функций отдельных генов. Напомним, что у прокариот регуляции зачастую подвержены сразу все гены оперона, за исключением аутогенного котроля, когда ген-регулятор находится среди структурных генов внутри оперона и позволяет регулировать оперон отдельными блоками.
Гены эукариот прерывистые , а именно, состоят из кодирующих участков – экзонов , и не кодирующих – интронов. Такую структуру генов называют интрон-экзонной или мозаичной структурой. Длина экзонов достигает 1000 пар нуклеотидов, а интронов – обычно 5000-20000 пар нуклеотидов. Структурная часть гена может включать 2-3 (иногда более) экзонов, разделенных длинными интронами. И хотя интронов обычно бывает немного, число их у разных видов и в разных генах может колебаться от 0 (в генах гистонов) до 51 (в структурном гене коллагена). Экзонов всегда больше, чем интронов, но на долю интронов приходится в 5-7 раз больше нуклеотидных пар, чем на долю экзонов, поскольку интроны длиннее. В зависимости от количества экзонов и интронов, а также от их длины зависит длина гена эукариот. У разных организмов она может сильно варьировать. Так, у дрозофилы средняя длина гена составляет 2 тис. п. н., а длина гена фиброина шелка у шелковичного червя достигает 16 тис. п.н.
Существование интронов в структурной части гена создает определенные трудности для реализации генетической информации, так как в транскрибируемой и-РНК оказываются «лишние» участки ДНК, которые впоследствии не должны транслироваться на рибосомах. Как же в клетке эукариот решается эта проблема? Решение было найдено американским ученым Филиппом Шарпом из Массачусетского технологического института, который открыл явление сплайсинга (от англ. to splace – сшивать без узлов).
Механизм сплайсинга. Сначала в ядре с участка хромосомы (гена) транскрибируется полностью последовательность ДНК с формированием про-и-РНК – незрелой, более длинной РНК, которая содержит как экзоны, так и интроны. Далее, когда про-и-РНК направляется из ядра в цитоплазму, при прохождении ядерной мембраны происходит сплайсинг -созревание про-и-РНК, в результате которого вырезаются интроны, а экзоны сшиваются между собой с помощью фермента, получившего название матураза . Для осуществления сплайсинга важную роль играют особые sРНК (длиной до 160 нуклеотидов), которые стягивают между собой концы интронов, что способствует их вырезанию и последующему сшиванию экзонов. В цитоплазму на рибосомы для трансляции поступает уже зрелая и-РНК, в которой нет интронов.
Интроны не всегда являются некодирующими участками. Так, у дрожжей в генах митохондрий обнаружены интроны, кодирующие синтез фермента матуразы, который участвует в вырезании интронов. В некоторых генах дрожжей обнаружены интроны, кодирующие цитохром В и т.д.
Сплайсинг осуществляется белковыми комплексами, получившими название сплайсосомы. В состав сплайсосом, помимо уже названных матураз и sРНК, входят еще белки, придающие про-и-РНК нужную конформацию. Кроме того, сплайсосома связана с ферментами, осуществляющими полиаденилирование 3 / -конца и-РНК.
Типы сплайсинга : простой; альтернативный; транссплайсинг; аутосплайсинг.
Простой сплайсинг характерендля простых генов, последовательность экзонов которых предназначена для синтеза только одного белка. В таких генах экзоны занимают на ДНК всегда фиксированное положение и удаление интронов всегда ведется в четко обозначенных точках.
Альтернативный сплайсинг характерен для генных участков, на которых закодированы сразу несколько белков. При этом одни и те же участки выступают то экзонами, то интронами. Так на одном участке ДНК кодируется нейропептид гипофиза и гормон паращитовидной железы. В зависимости от вырезания тех или иных участков ДНК образуется и-РНК, кодирующая тот или иной белок. Альтернативный сплайсинг имеет место при синтезе иммуноглобулинов (антител) и при синтезе антигенов тканевой совместимости (МНС).
Транссплайсинг п роисходит, если в одну молекулу и-РНК объединяются экзоны из разных генов. Характерен для синтеза компонентов цитоскелета клетки.
Аутосплайсинг обнаружен впервые в макронуклеусе инфузорий, а позже у бактерий, дрозофил и других эукариот. Аутосплайсинг – самонарезание про-и-РНК без участия матураз и других ферментов. РНК, которая сама вырезает из себя интроны, получила название рибозим . Аутосплайсинг свидетельствует о том, что первой молекулой, несущей генетическую информацию, в эволюции была РНК. Она выполняла и генетическую и каталитическую функции, переданные позднее ДНК и белкам соответственно.
Как же в структуре генов образовались некодирующие интроны? Существует гипотеза, что еще на заре эволюции эукариот, они заражались вирусами и за счет интеграции в геном вирусной ДНК в хромосомах появилась избыточная сателлитная (эгоистическая) ДНК . Она присутствует не только в интронных последовательностях генов, но и разбросана по всей длине хромосом в виде огромных вставок некодирующих последовательностей.
У эукариот, так же как и у вирусов, встречаются перекрывающиеся гены , а именно на одном и том же участке ДНК с разных точек (и/или на разных цепях) может начинаться транскрипция с образованием разных и-РНК, кодирующих разные полипептиды.
Репликация у эукариот множественная, в каждой хромосоме существует 20-100 сайтов начала репликации и соответствующее число репликонов. Репликация в них может идти не одномоментно, однако деление клетки не начинается, пока не реплицированы все хромосомы на всем их протяжении. Подробно репликация рассмотрена в отдельной лекции (см. выше).
Транскрипция и трансляция у эукариот разобщены из-за наличия ядерной мембраны, а именно, транскрипция осуществляется в ядре, а образующаяся при этом информационная РНК должна транспортироваться из ядра в цитоплазму для последующего синтеза белка (трансляции) на рибосомах. Уже говорилось о том, что при преодолении ядерной мембраны происходит сплайсинг, т.е. созревание и-РНК. На все эти процессы необходимо время, поэтому от момента инициации транскрипции до появления белкового продукта в процессе трансляции проходит 6-24 часа. Для сравнения: у прокариот это время составляет 2-3 минуты.
Для прокариот характерна относительно простая структура генов. Так, структурный ген бактерии, фага или вируса, как правило, контролирует одну ферментативную реакцию. Специфичным для прокариот является оперонная система организации нескольких генов. Гены одного оперона (участка генетического материала, состоящего из 1, 2 и более сцепленных структурных генов, которые кодируют белки (ферменты), осуществляющие последовательные этапы биосинтеза какого-либо метаболита; в оперон эукариот входит, как правило, 1 структурный ген; оперон содержит регуляторные элементы) расположены в кольцевой хромосоме бактерии рядом и контролируют ферменты, осуществляющие последовательные или близкие реакции синтеза (лактозный, гистидиновый и др. опероны). Эукариотические гены, в отличие от бактериальных, имеют прерывистое мозаичное строение. Кодирующие последовательности (экзоны) перемежаются с некодирующими (интронами). Экзон - участок гена, несущий информацию о первичной структуре белка. В гене экзоны разделены некодирующими участками - интронами. Интрон - участок гена, не несущий информацию о первичной структуре белка и расположенный между кодирующими участками - экзонами. В результате структурные гены эукариот имеют более длинную нуклеотидную последовательность, чем соответствующая зрелая иРНК, последовательность нуклеотидов в которой соответствует экзонам. В процессе транскрипции информация о гене списывается с ДНК на промежуточную иРНК, состоящую из экзонов и интронов. Затем специфические ферменты - рестриктазы - разрезают эту про-иРНК по границам экзон-интрон, после чего экзонные участки ферментативно соединяются вместе, образуя зрелую иРНК (так называемый сплайсинг). Количество интронов может варьировать в разных генах от нуля до многих десятков, а длина - от нескольких пар оснований до нескольких тысяч. СТРОЕНИЕ ОПЕРОНОВ: Оперон - это блок генов, участвующих в обеспечении транскрипции генов, ответственных за синтез определенного генопродукта.
Схема оперона:
Регуляторная часть оперона:
А - активатор, часть промотора, к которому присоединяется белок-активатор (САР - белок или catabolite activator protein), что активирует присоединение РНК- полимеразы к промотору; это "положительно" контролирующий элемент, который есть не в каждом опероне.
П - ген-промотор - это участок ДНК, который распознается ферментом РНК - полимеразой и указывает место, где должна начинаться транскрипция.
О - ген-оператор, управляющей работой структурных генов; "негативно" контролирующий элемент - присутствие на нем белка-репрессора прекращает транскрипцию.
Т - ген-терминатор - это участок, после которого прекращается транскрипция и перед которым прекращается трансляция. В состав этого участка входит один из трех кодонов терминаторов (стоп-кодонов). В некоторых оперонах между оператором и структурными генами расположен участок(16 пар оснований), частью которого является аттенуатор, служащий барьером для транскрипции. Подобная структура есть в триптофановом опероне кишечной палочки (Escherichia coli).
Цистронная часть оперона: В, С, Д, Е – структурные гены, кодирующие соответствующие белки; структурные гены одного оперона включаются и выключаются одновременно. Транскрипция группы структурных генов (цистронов) контролируется геном-регулятором и геном оператором. Оператор состоит приблизительно из 30 нуклеотидов. Генетические дефекты в операторе приводят к непрерывному синтезу ферментов, т.е. регуляция синтеза генопродукта нарушается. Ген-регулятор контролирует синтез белка репрессора, не входит в состав оперона и может находиться на разном расстоянии от оперона. Регуляторный белок репрессор определяет активность оперона. Он имеет два функциональных центра: 1) место связывания с опероном; 2) место связывания с индуктором или корепрессором. Большее сродство белок репрессор имеет ко второй группе веществ, которые высокоспецифичны. Оперон активен, если оператор свободен от репрессора. Этот белок с оператора снимается, если к его второму активному центру присоединяется вещество, называемое индуктором (по химической природе оно может быть различным). Следовательно, регуляторные белки либо запускают, либо блокируют транскрипцию цистронной части оперона. Таким образом, анализируя механизмы регуляции экспрессии генов у прокариот, можно выделить три типа регуляторных элементов.
1. Регуляторные белки – белки, влияющие на активность РНК-полимеразы, т.к. или позволяют ей связываться с промотором или нет; или открывают ей доступ к следующим после промотора нуклеотидам ДНК, или закрывают, соединяясь с оператором. Активность регуляторных белков изменяется с помощью специфического связывания с низкомолекулярными эффекторами (индукторами, корепрессорами).
2. Эффекторы - небольшие небелковые молекулы, концентрация которых в клетке отражает её состояние. В качестве эффектора могут выступать циклический аденозинмонофосфат, триптофан, лактоза и др.
3. Регуляторные нуклеотидные последовательности оперона (промоторы, операторы, терминаторы, аттенуаторы), действуя на которые регуляторные белки влияют на уровень синтеза соответствующих и-РНК.
Загрузка...
