Условие эпр. Электронный парамагнитный резонанс (ЭПР)

ЭЛЕКТРОННЫЙ ПАРАМАГНИТНЫЙ РЕЗОНАНС (ЭПР) - резонансное поглощение электромагнитных волн веществами, содержащими парамагнитные частицы. Методы, основанные на ЭПР, нашли широкое применение в лабораторной практике. С их помощью изучают кинетику химических и биохимических реакций (см. Кинетика биологических процессов , Кинетика химическая), роль свободных радикалов в процессах жизнедеятельности организма в норме и при патологии (см. Радикалы свободные), механизмы возникновения и течения фотобиологических процессов (см. Фотобиология) и т. д.

Явление ЭПР было открыто советским ученым Б. К. Завойским в 1944 году. Электронный парамагнитный резонанс характерен только для парамагнитных частиц то есть частиц, способных намагничиваться при приложении к ним магнитного поля) с нескомпенсированным электронным магнитным моментом, который, в свою очередь, обусловлен собственным механическим моментом электрона - спином. Электронам присуще особого рода внутреннее движение, которое можно сравнить с вращением волчка вокруг своей оси. Связанный с ним момент количества движения называют спином. Благодаря спину электрон обладает постоянным магнитным моментом, направленным противоположно спину. В большинстве молекул электроны располагаются на орбиталях таким образом, чего их спины направлены противоположно, магнитные моменты скомпенсированы, и сигнал ЭПР от них наблюдать не удается. Если магнитное поле электрона не скомпенсировано спином другого электрона (то есть молекула содержит неспаренные электроны), то регистрируется сигнал ЭПР. Частицами с неспаренными электронами являются свободные радикалы, ионы многих металлов (железо, медь, марганец, кобальт, никель и др.), ряд свободных атомов (водород, азот, щелочные металлы и др.).

В отсутствие внешнего магнитного поля направление (ориентация) магнитного момента электрона в пространстве может быть любым; энергия такого электрона не зависит от ориентации его магнитного момента. В соответствии с законами квантовой механики во внешнем магнитном поле ориентация магнитного момента электрона не может быть произвольной - он может быть направлен либо по направлению магнитного поля, либо противоположно ему.

В соответствии с ориентацией магнитного момента электрона его энергия в магнитном поле также может принимать лишь два значения: минимальное Е1 - при ориентации магнитного момента «по полю» и максимальное Е2 - при его ориентации «против поля» и разница в энергиях этих состояний (дельта Е) вычисляется по формуле: ΔЕ = gβH, где β - магнетон Бора (единица измерения магнитного момента электрона), H - напряженность магнитного поля, g - константа, зависящая от электронной структуры парамагнитной частицы. Если на систему неспаренных электронов во внешнем магнитном поле подействовать электромагнитным излучением, энергия кванта которого равна ΔE, то под влиянием излучения электроны начнут переходить из состояния с меньшей энергией в состояние с большей энергией, что будет сопровождаться поглощением излучения веществом.

ЭПР относят к методам радиоспектроскопии, поскольку для наблюдения электронного парамагнитного резонанса применяются излучения в радиочастотном диапазоне электромагнитных волн.

ЭПР регистрируется с помощью специальных приборов - радиоспектрометров. В их состав входят: электромагнит, источник радиочастотного излучения, линия передачи излучения от источника к образцу (волновод), резонатор, в котором находится исследуемый образец, системы детектирования, усиления и регистрации сигнала. Наиболее распространены радиоспектрометры, в которых используются электромагнитные излучения с длинами волн 3,2 см или 8 мм.

Регистрация сигнала ЭПР производится следующим образом. Напряженность магнитного поля, создаваемого электромагнитом, линейно изменяется в определенных пределах. При значениях напряженности, отвечающих условию резонанса, образец поглощает энергию электромагнитного излучения. Линия поглощения (сигнал ЭПР) представляет собой зависимость мощности излучения, поглощенного образцом, от напряженности магнитного поля. В существующих радиоспектрометрах сигнал ЭПР регистрируется в виде первой производной линии поглощения.

Для описания и анализа спектров ЭПР используется ряд параметров, характеризующих интенсивность линий, их ширину, форму, а также положение в магнитном поле. Интенсивность линий ЭПР при прочих равных условиях пропорциональна концентрации парамагнитных частиц, что позволяет проводить количественный анализ.

При рассмотрении явления ЭПР следует учитывать, что магнитный момент неспаренного электрона взаимодействует не только с магнитным полем электромагнита, но и с магнитными полями, создаваемыми окружением электрона: другими неспаренными электронами, магнитными ядрами (см. Ядерный магнитный резонанс). Взаимодействие неспаренных электронов с ядрами часто приводит к расщеплению спектра ЭПР на ряд линий. Анализ таких спектров позволяет идентифицировать природу парамагнитных частиц, оценивать характер и степень их взаимодействия друг с другом.

Участие парамагнитных частиц в химических реакциях, молекулярное движение и другие кинетические эффекты также влияют на форму спектра ЭПР. Поэтому ЭПР используют для обнаружения, оценки количества и идентификации парамагнитных частиц, исследования кинетики химических и биохимических реакций и молекулярной динамики.

Благодаря своей универсальности ЭПР находит широкое применение в различных областях науки. Использование ЭПР в биологии и медицине обусловлено наличием в клетках, тканях и биол. жидкостях различных по природе парамагнитных центров. С помощью ЭПР было обнаружено наличие свободных радикалов практически во всех животных и растительных тканях. Источником свободных радикалов служат такие соединения, как флавины, коэнзим Q и другие вещества, выполняющие роль переносчиков электронов В реакциях энергетического обмена в растительной и животной клетке; парамагнитные центры, обнаруживаемые в изолированных тканях, принадлежат в основном электрон-транспортным цепям митохондрий, микросом, хлоропластов (см. Дыхание). Обнаружено, что содержание свободных радикалов в тканях коррелирует с их метаболической активностью. В многочисленных работах показано изменение количества свободных радикалов при различных патологических состояниях, например при онкогенезе (см.), развитии лучевых повреждений (см.), токсикозе (см. Интоксикация), что объясняется нарушением энергетического метаболизма при патологии (см. Биоэнергетика).

С помощью ЭПР в тканях животных и растений определяют парамагнитные ионы (железа, меди, марганца, кобальта и т. д.), которые входят в состав металлопротеидов, участвующих в реакциях переноса электронов по электронтранспортным цепям и ферментативном катализе, а также в кислородпереносящих пигментах (гемоглобине). С помощью ЭПР удается исследовать окислительно-восстановительные превращения ионов металлов и характер взаимодействия ионов с их окружением, что позволяет установить тонкую структуру металлосодержащих комплексов.

Патологические изменения тканей приводят к изменениям сигналов ЭПР металлопротеидов, что связывают с распадом парамагнитных комплексов металлов, изменением окружения парамагнитных ионов, переходом ионов в другие комплексы. Однако исследование природы парамагнитных центров тканей, особенно свободных радикалов, связано с определенными трудностями из-за сложности расшифровки спектров ЭПР.

С помощью ЭПР оказалось возможным исследовать механизмы ферментативных реакций (см. Ферменты). В частности, удается одновременно изучать как кинетику образования и расходования свободных радикалов в ходе ферментативных реакций, так и кинетику окислительно-восстановительных превращений металлов, входящих в состав ферментов, что позволяет устанавливать последовательность стадий ферментативной реакции.

Применение ЭПР при исследовании лучевого поражения в биол. объектах позволяет получать информацию о природе образующихся в биополимерах радикалов, о механизмах и кинетике радикальных реакций, развивающихся в облученных объектах и приводящих к биологическому эффекту. Метод ЭПР может быть применен в аварийной дозиметрии, например при случайном облучении людей для оценки дозы облучения, используя для этого предметы из зоны облучения.

Важное место занимает ЭПР в исследовании фотобиологических процессов, протекающих с участием свободных радикалов (см. Молекула , Радикалы свободные , Фотобиология , Фотосенсибилизация). С помощью ЭПР подробно изучают процессы образования свободных радикалов в белках, нуклеиновых кислотах и их компонентах при действии ультрафиолетового излучения, роль этих радикалов в фотодеструкции биополимеров (см. Свет). Применение ЭПР дало важную информацию о первичных механизмах фотосинтеза (см.). Показано, что первичной реакцией фотосинтеза является перенос электрона от возбужденной светом молекулы хлорофилла и образование катион-радикала хлорофилла. Идентифицирована и природа молекул, акцептирующих электрон, отдаваемый возбужденной молекулой хлорофилла.

ЭПР применяется также и для исследования структуры биологически важных макромолекул и биомембран. Например, ионы железа, входящие в состав гема в гемсодержащих белках, могут находиться в высокоспиновом состоянии (электроны на внешних орбитах не спарены, суммарный спин максимален) и низкоспиновом (внешние электроны полностью или частично спарены, спин минимален). Исследования особенностей сигналов ЭПР высокоспиновых и низкоспиновых состояний ионов железа в гемоглобине и его производных способствовали пониманию пространственной структуры молекулы гемоглобина.

Значительные успехи в изучении структуры биомембран и биополимеров были достигнуты после появления методов спиновых зондов и меток (см. Мембраны биологические). В качестве спиновых меток и зондов в основном используются стабильные нитроксильные радикалы (см. Радикалы свободные). Нитроксильный радикал может быть ковалентно связан с молекулами (спиновая метка) либо удерживаться в исследуемой системе за счет физических взаимодействий (спиновой зонд). Сущность заключается в том, что форма спектра ЭПР нитроксильных радикалов зависит от свойств микроокружения: вязкости, характера и молекулярного движения, локальных магнитных полей и др. Спин-метки, ковалентно связанные с различными группами биополимеров, являются индикатором состояния структуры биополимера. С помощью спиновых меток исследуются пространственная структура биополимеров, структурные изменения белков при денатурации, образовании комплексов фермент - субстрат, антиген - антитело и т.д.

С помощью метода спиновых зондов изучаются способы упаковки и подвижность липидов в биомембранах, липид-белковые взаимодействия, структурные переходы в мембранах, вызванные действием различных веществ и т.д. На основе исследования спиновых меток и зондов предложены методы определения лекарственных средств в биол. жидкостях, а также исследуются вопросы направленного транспорта лекарственных средств и т. д.

Таким образом, с помощью ЭПР показано широкое распространение электронных процессов в организме в норме и при возникновении какой-либо патологии. Создание теории и совершенствование техники метода ЭПР легло в основу квантовой электроники как раздела науки, привело к созданию молекулярных генераторов и усилителей радиоволн (мазеров) и света - лазеров (см.), нашедших широкое применение во многих областях народного хозяйства.

Блюменфельд Л. А., Воеводский В. В. и Семенов А. Г. Применение электронного парамагнитного резонанса в химии, Новосибирск, 1962, библиогр.; Вертц Дж. и Болтон Дж. Теория и практические приложения метода ЭПР, пер. с англ.. М., 1975, библиогр.; Ингрэм Д. Электронный парамагнитный резонанс в биологии, пер. с англ.. М., 1972; Калмансон А. Э. Применение метода электронного парамагнитного резонанса в биохимии, в кн.: Усп. биол. хим., под ред. Б. Н. Степаненко, т. 5, с. 289, М., 1963; Кузнецов А. Н. Метод спинового зонда. М., 1976; Лихтенштейн Г. И. Метод спиновых меток в молекулярной биологии, М., 1974; Метод спиновых меток, под ред. Л. Берлинера, пер. с англ., М., 1979; Свободные радикалы в биологии, под ред. У. Прайора, пер. с англ., т. 1, с. 88, 178, М., 1979.

К. Н. Тимофеев.

Явление магнитного резонанса. Электронный парамагнитный резонанс (ЭПР)

В предыдущем параграфе рассматривалось расщепление спектральных линий, связанное с переходами между подуровнями расщепленных в магнитном поле разных энергетических уровней. Такие переходы соответствуют оптическому диапазону частот. Наряду с этим в дипольном приближении возможны переходы между соседними подуровнями расщепившегося в магнитном поле уровня энергии согласно правилам отбора:

Из формулы (3.95) следует, что таким переходам соответствуют частоты:

При В ~ 0,3 Тл частота v * Ю 10 Гц, а длина волны X ~ 3 см. Это - микроволновый диапазон частот, или диапазон СВЧ. Вероятность дипольных переходов пропорциональна v 3 , поэтому в СВЧ-диапазо- не она ничтожно мала по сравнению с вероятностью в оптическом диапазоне. Кроме того, для атомов с одним валентным электроном переходы в этом случае запрещены правилом отбора AL = ±. Однако вероятность переходов становится значительной при наложении дополнительного внешнего переменного магнитного поля, т. е. когда переходы становятся вынужденными. Из дальнейшего будет ясно, что переменное магнитное поле должно быть перпендикулярным стационарному магнитному полю, вызывающему зеемановское расщепление уровней энергии. Если частота переменного магнитного поля равна частоте перехода (3.101), то происходит поглощение его энергии или вынужденное излучение. При этом скачком изменяется ориентация магнитного момента атома, т. е. его проекция на выделенное направление.

Излучение или поглощение электромагнитных волн при изменении ориентации магнитных дипольных моментов атомов в магнитном поле называют явлением магнитного резонанса.

Последовательное описание магнитного резонанса довольно сложно. Качественную картину этого явления можно понять на основе простой классической модели. Если частица обладает магнитным моментом М, то во внешнем постоянном магнитном поле В 0 =(0,0, В 0) на нее действует вращающий момент К = МхВ 0 . Поскольку магнитный М и механический J моменты частицы (например, электрона в атоме) связаны соотношением:

где у - гиромагнитное отношение, y = gi b /h = eg/2m e , то уравнение движения можно записать в виде:

Это уравнение волчка, которое показывает, что механический и магнитный моменты совершают прецессию вокруг В 0 . Угловая скорость (частота) этой прецессии равна:

В магнитном поле, направленном вдоль оси z , частица приобретает дополнительную энергию:

Частота перехода между соседними подуровнями энергии совпадает с частотой прецессии:

Рис. 3.34

Если добавить изменяющееся с частотой ш магнитное поле В, перпендикулярное стационарному полю В 0 (рис. 3.34), то на частицу будет действовать дополнительный переменный вращающий момент [МхВ,1. Когда частоты прецессии и изменения поля В! сильно отличаются друг от друга, то при |В,|z, так что в среднем этот угол не меняется. Однако, если частота изменения поля В, совпадает с частотой прецессии (3.104), то магнитный момент оказывается как бы в статических условиях и дополнительный вращающий момент стремится его «опрокинуть». Поскольку магнитный момент является квантовым вектором, то его проекция на направление статического магнитного поля может измениться только скачком, что соответствует переходу на соседний расщепленный подуровень. В этом и состоит явление магнитного резонанса.

Если магнитный и механический моменты атома обусловлены его электронами, то в этом случае магнитный резонанс называют электронным парамагнитным резонансом (ЭПР). Когда моменты определяются ядром атома, то магнитный резонанс называют ядерным магнитным резонансом (ЯМР), который впервые наблюдал в опытах с молекулярными пучками Раби в 1938 г. Существуют также ферромагнитный и антиферромагнитный резонансы , связанные с изменением ориентации электронных магнитных моментов в ферромагнетиках и антиферромагнетиках. Далее рассмотрим подробнее ЭПР.

Электронным парамагнетизмом обладают: все атомы и молекулы с нечетным числом электронов (неспаренные, некомпенсированные электроны) на внешних электронных оболочках, поскольку в этом случае полный спин системы не равен нулю (свободные атомы натрия, газообразный оксид азота и т. д.); атомы и ионы с незаполненной внутренней электронной оболочкой (редкоземельные элементы, актиниды и др.) и т. д. ЭПР представляет собой совокупность явлений, связанных с квантовыми переходами, происходящими между энергетическими уровнями макроскопических систем под влиянием переменного магнитного поля резонансной частоты.

В эксперименте явление ЭПР впервые наблюдал Е. К. Завойский в 1944 г. ЭПР служит мощным средством изучения свойств парамагнитных веществ в макроскопических количествах. В этом случае имеется не одна, а много частиц, обладающих магнитными моментами. Макроскопической магнитной характеристикой вещества является вектор намагничивания 1 = , где N - число частиц в единице

объема вещества; - средний магнитный момент частиц. Систему моментов всех парамагнитных частиц данного вещества называют спин-системой. Остальные степени свободы парамагнетика - окружение магнитных моментов - называют «решеткой». В связи с этим рассматривают два типа взаимодействия: магнитных моментов между собой (спин-спиновое взаимодействие) и магнитных моментов со своим окружением (спин-решеточнос взаимодействие). В изолированной спин-системе не происходит стационарного поглощения энергии переменного поля. В самом деле до включения переменного магнитного поля число частиц в основном состоянии больше их числа N 2 в возбужденном состоянии. При поглощении энергии число частиц JV, уменьшается, а число N 2 увеличивается. Это будет происходить, пока N ] и N 2 не сравняются. Тогда достигается насыщение, и дальнейшее поглощение энергии прекращается. С учетом взаимодействия спин-системы с решеткой стационарное поглощение энергии становится возможным. Решетка служит в качестве стока энергии и в процессе нагревается.

Изменение вектора намагничивания описывается уравнением Блоха:

где a = (x,y,z)‘ t у - гиромагнитное отношение; 1 0 - равновесное значение вектора намагничивания в постоянном магнитном поле в 0 =(0,0, В 0); т х - время спин-спиновой (или поперечной) релаксации, т х =т у =т 2 ; t z - время спин-решеточной (или продольной)

релаксации, т^ =т,. Значения величин т, и т 2 зависят от особенностей взаимодействия каждой частицы с окружающими ее частицами. Определение этих времен релаксации является основной экспериментальной задачей метода магнитного резонанса. В уравнении

(3.106) первый член записан по аналогии с уравнением движения одиночного магнитного момента (3.103). Второй член обусловлен спин-спиновым и спин-решеточным взаимодействиями, которые определяют достижение системой равновесного состояния.

Поглощаемая парамагнитным веществом мощность излучения /(со) вычисляется с помощью уравнения (3.106). Она определяется формулой

где А - некоторый множитель; В ] - амплитуда переменного магнитного поля. Форма кривой поглощения определяется функцией

где о) 0 - частота прецессии, о) 0 =у# 0 .

Отсюда видно, что поглощение носит резонансный характер (рис. 3.35). Кривая поглощения имеет лоренцевскую форму и достигает максимума при резонансе: со=со 0 . Ширина линии поглощения:

В достаточно слабом высокочастотном магнитном поле ширина кривой поглощения определяется временем спин-спиновой релаксации. С увеличением этого поля линия поглощения уширяется. По ширине кривой поглощения определяют времена релаксации, которые связаны со свойствами вещества. Для достижения резонанса на опыте оказывается удобнее изменять не частоту о переменного магнитного поля, а частоту прецессии с помощью изменения постоянного магнитного поля.

На рис. 3.36 изображена одна из простых схем радиоспектроскопа для наблюдения ЭПР - радиоспектроскопа с волноводным мостом. Он содержит стабильный источник ВЧ-излучения - клистрон, настраиваемый объемный резонатор с исследуемым образцом, и измерительную систему для детектирования, усиления и индикации сигнала. Энергия клистрона наполовину идет в плечо резонатора, содержащего исследуемый образец, и наполовину в другое плечо к согласованной нагрузке. При настройке винтом можно сбалансировать мост. Если потом с помощью модуляционных катушек менять постоянное магнитное поле, то при резонансе резко возрастает поглощение энергии образцом, что приводит к разбалансировке моста. Тогда после усиления сигнала осциллограф прописывает резонансную кривую.

Метод ЭПР обладает высокой чувствительностью. Он позволяет измерять времена релаксации, ядерные магнитные моменты, проводить количественный анализ любых парамагнитных веществ вплоть до 10 -12 г вещества, определять структуру химических соединений.

электронные конфигурации, измерять слабые напряженности магнитного поля до 79,6 А/м и т. д.

Покажем, как можно рассчитать мощность излучения, поглощаемого парамагнитным веществом (3.107). Представим переменное магнитное поле, вращающееся по часовой стрелке (в направлении прецессии магнитного момента) в комплексной форме:

B(t}= = 2?,coso)/-/"#, sinw/ = 2? u +iB ly . Можно также ввести

комплексный вектор намагничивания /(/)= / и +И { 9 который связан с комплексным вектором переменного магнитного поля соотношением / = х(о>)Я, где x(w) - комплексная магнитная восприимчивость. Такое соотношение вводится аналогично статическому случаю, когда магнитное поле B Q постоянно: / 0 = х 0 ? 0 , где %о~ ста " тическая магнитная восприимчивость. Из уравнений Блоха (3.106) получаем

В установившемся режиме имеем: - = -/о)/, -- = 0. Тогда из

системы (3.110) следует система уравнений:

Решение этой системы:

Среднюю за период поля поглощаемую мощность можно вычислить по формуле

Отсюда следует, что поглощаемая мощность определяется мнимой частью комплексной магнитной восприимчивости.

С помощью метода магнитного резонанса были получены многие фундаментальные результаты. В частности, был измерен аномальный магнитный момент электрона. Оказалось, что спиновый магнитный момент электрона не равен точно одному магнетону Бора, т. е. для электрона гиромагнитное отношение g e ^2. Об этом уже говорилось в §2.7. Был измерен также магнитный момент нейтрона и т. д. На основе этого метода был создан атомно-лучевой стандарт частоты и времени - атомихрон с использованием пучка атомов цезия Cs 133

1. В свободном ионе Си 2+ не хватает одного электрона в З^-обо- лочке. Определить частоту парамагнитного резонанса в магнитном поле 421,88-10 3 А/м.

Решение. Основное состояние - /)-состояние (L = 2) со спином 5= 1/2. По правилу Хунда число /= L + 5= 5/2. В отсутствие магнитного поля этот уровень не расщеплен с кратностью вырождения (25+ 1)(2Z.+ 1)= 10. В постоянном магнитном поле уровень расщепляется на 2/+ 1 =6 подуровней. Фактор Ланде g=6/5. Частота парамагнитного резонанса определяется по формуле (3.101).

ЭЛЕКТРОННЫЙ ПАРАМАГНИТНЫЙ РЕЗОНАНС (ЭПР) - резонансное поглощение (излучение) эл--магн. волн радиочастотного диапазона (10 9 -10 12 Гц) парамагнетиками, парамагнетизм к-рых обусловлен электронами. ЭПР - частный случай парамагн. резонанса и более общего явления - магнитного резонанса . Лежит в основе радио-спектроскопич. методов исследования вещества (см. Радио-спектроскопия) . Имеет синоним - электронный спиновый резонанс (ЭСР), подчёркивающий важную роль в явлении спинов электронов. Открыт в 1944 E. К. Завойским (СССР). В качестве парамагн. частиц (в случае конденсированных сред-парамагн. центров), определяющих парамагнетизм, могут выступать электроны, атомы, молекулы, комплексные соединения, дефекты кристалла, если они обладают отличным от нуля магнитным моментом . Источником возникновения магн. момента могут служить неспаренный спин или отличный от нуля суммарный спин (момент кол-ва движения) электронов.

В постоянных магн. полях в результате снятия вырождения у парамагн. частицы возникает система магн. (спиновых) подуровней (см. Зеемана эффект ).Между ними под действием эл--магн. излучения возникают переходы, приводящие к поглощению (излучению) фотона с частотой w ij = | |/.В случае одного электрона в постоянном магн. поле H энергии подуровней = bg bH/ 2 и соответственно частота ЭПР w определяется соотношением

где g - фактор спектроскопич. расщепления; b - магнетон Бора; обычно, H = 10 3 5-10 4 Э; g2.

Экспериментальные методы . Спектрометры ЭПР (радиоспектрометры) работают в сантиметровом и миллиметровом диапазонах длин волн. Используется техника СВЧ-диапазона - генератор (обычно клистрон ),система волноводов и резонаторов с детектирующим устройством. Образец объёмом в неск. мм 3 помещается в область резонатора, где составляющая эл--магн. волны (обычно магнитная), вызывающая переходы, имеет пучность. Резонатор устанавливается между полюсами электромагнита - источника постоянного магн. поля. Резонансное условие типа (1) обычно достигается путём изменения напряжённости поля H при фиксированном значении частоты генератора w. Значение магн. поля при резонансе (H р) в общем случае зависит от ориентации вектора H по отношению к образцу. Сигнал поглощения в виде типичного колоколообраз-ного всплеска или его производной (рис. 1) наблюдается с помощью осциллоскопа или самописца. Наиб. часто исследуется сигнал поглощения, пропорциональный мнимой части динамической магн. восприимчивости (c"") образца. Однако в ряде случаев регистрируется её действительная часть (c"), определяющая долю намагниченности, меняющуюся синфазно с магн. компонентой эл--магн. волны. ЭПР может проявляться в виде микроволновых аналогов оптич. эффектов Фарадея и Коттона - Мутона. Для их регистрации используются волноводы, в конце к-рых устанавливаются спец. антенны, вращающиеся вокруг оси волновода и измеряющие поворот плоскости поляризации или эллиптичность волны, вышедшей из образца. Широкое распространение получили импульсные методы, позволяющие анализировать временные зависимости сигналов ЭПР (т. н. спиновую индукцию и спиновое эхо ).Существует и ряд др. методик для изучения релаксац. процессов, в частности для измерения времён релаксации.

Рис. 1. Электронный парамагнитный резонанс: а - парамагнитная частица со спином S= 1 / 2 , помещён ная во внешнее магнитное поле, имеет два подуровня ( и ), каждый из которых изменяется пропор ционально полю H и зависит от его ориентации по отношению к кристаллографическим осям, задавае мой углами q и f. При резонансных значениях магнит ного поля H р1 и H р2 (углы q 1 , (j 1 и q 2 , j 2) разность становится равной кванту энергии СВЧ -излучения. При этом в спектре поглощения (б )наблю даются характерные всплески вблизи Н р 1 и H p 2 (при ведены сигнал поглощения и его производная) .

Теоретическое описание . Для описания спектра ЭПР используется спиновый гамильтониан ,к-рый для каждого конкретного случая имеет свой вид. В общем случае он может быть представлен в форме, учитывающей все возможные взаимодействия парамагн. частицы (центра):

где описывает взаимодействие с внеш. магн. полем H ; - взаимодействие с внутрикристаллич. электрич. полем; - с магн. моментом собственного и окружающих ядер (сверхтонкое взаимодействие и суперсверхтонкое взаимодействие); - спин-спиновые взаимодействия парамагн. центров между собой (обменное взаимодействие, диполь-дипольное и др.); -взаимодействие с приложенным внеш. давлением P (деформациями); -с внеш. электрич. полем E . Каждое слагаемое, входящее в (2), может состоять из неск. членов, вид к-рых зависит от величины электронных и ядерных спинов и локальной симметрии центра. Часто встречающиеся выражения имеют вид;

где g, a, A, J, С, R -параметры теории, S (i} и I (k ) - i -й и k -й спины электронов и ядра; -единичная матрица. Спиновый гамильтониан (2) обычно относят к одному электронному или электронно-колебат. терму (обычно основному), предполагая, что другие термы отстоят от него на величину, значительно превышающую энергию кванта ЭПР-перехода. Но в ряде случаев, напр. при наличии Яна-Теллера эффекта , возбуждённые термы могут находиться достаточно близко и их необходимо учитывать при описании спектров ЭПР. Тогда для сохранения формализма спинового гамильтониана можно ввести эфф. спин (S эф), связанный с общим числом состояний всех уровней (r )соотношением r = 2S эф +1. Другой подход возможен в рамках метода матрицы возмущения: находится полная матрица оператора возмущения на всех состояниях учитываемых уровней.

Каждое из слагаемых (2) может быть разделено на две части: статическую и динамическую. Статич. часть определяет положение линий в спектре, динамическая - вероятности квантовых переходов, в т. ч. обусловливающих и ре-лаксац. процессы. Энергетич. структуру и волновые ф-ции находят, решая систему ур-ний, соответствующую (2). Число ур-ний равно

где n и p -число фигурирующих в (2) спинов электронов и ядер. Обычно S и I принимают значения от 1 / 2 до 7 / 2 ; п= 1, 2; p= l-50, что указывает на возможность существования секулярных ур-ний высокого порядка. Для преодоления техн. трудностей при диагонализации (2) используют приближённые (аналитические) расчёты. Не все слагаемые (2) одинаковы по величине. Обычно и превосходят др. члены, а и значительно меньше предыдущих. Это позволяет развить теорию возмущений в неск. этапов. Кроме того, разработаны спец. программы для ЭВМ.

Цель феноменологич. теории - нахождение для определ. перехода выражения для H р в ф-ции параметров спинового гамильтониана и углов, характеризующих ориентацию внеш. полей относительно кристаллографич. осей. Сопоставлением (H р) теор с (H р) эксп устанавливается правильность выбора (2) и находятся параметры спинового гамильтониана.

Параметры спинового гамильтониана рассчитываются независимо с помощью методов квантовой механики, исходя из определ. модели парамагн. центра. При этом используют теорию кристаллич. поля, метод молекулярных орбиталей, др. методы квантовой химии и теории твёрдого тела. Осн. трудность этой проблемы состоит в определении электронной энергетич. структуры и волновых ф-ций парамагн. центров. Если эти составляющие ур-ния Шрёдингера найдены, а операторы возмущения известны, задача сводится к вычислению лишь соответствующих матричных элементов. В силу сложности всего комплекса проблем полных расчётов параметров спинового гамильтониана проведено пока мало и не во всех из них достигнуто удовлетворитю согласие с экспериментом. Обычно ограничиваются оценками по порядку величины, используя приближённые ф-лы.

Спектр ЭПР (число линий, их зависимость от ориентации внеш. полей относительно кристаллографич. осей) полностью определяется спиновым гамильтонианом. Так, при наличии лишь зеемановского взаимодействия выражение для энергии имеет вид=g bH + M , где M - квантовое число оператора , принимающее 2S +1 значений: - S, - S+ 1, .... S -1, S. Магн. составляющая эл--магн. волны в данном случае вызывает лишь переходы с правилами отбора DM = b 1, и, в силу эквидистантности уровней, в спектре ЭПР будет наблюдаться одна линия. Нарушение эквидистантности возникает за счёт др. слагаемых спинового гамильтониана. Так, аксиально симметричное слагаемое из , характеризуемое параметром D , добавляет к член , H р оказывается зависящим от M , и в спектре будет наблюдаться 2S линий. Учёт слагаемого AS z I z из приводит к добавке (D ) ст = АМт , где т - квантовое число оператора I z ; H р будет зависеть от m , и в спектре ЭПР будет 2I+ 1 линия. Другие слагаемые из (2) могут приводить к дополнительным, "запрещённым" правилам отбора (напр., DM = b2), что увеличивает число линий в спектре.

Специфическое расщепление линий возникает под действием электрич. поля (слагаемое ). В кристаллах часто (корунд, вольфрамиты, кремний) существуют инверсионно неэквивалентные положения, в к-рых могут с равной вероятностью находиться примесные ионы. Так как магн. поле нечувствительно к операции инверсии, оно эти положения не различает, и в спектре ЭПР линии от них совпадают. Приложенное к кристаллу электрич. поле для разных неэквивалентных положений в силу их взаимной инвертированности будет направлено в противоположные стороны. Поправки к H р (линейные по E )от разных положений будут с противоположными знаками, и смешение двух групп линий проявится в виде расщепления.

В отсутствие магн. поля ( =0) расщепление уровней, называемое начальным, обусловлено др. членами (2). Число возникающих уровней, кратность их вырождения зависят от величины спина и симметрии парамагн. центра. Между ними возможны переходы (соответствующее явление получило назв. б е с п о л е в о г о р е з о н а н с а). Для его осуществления можно менять частоту v эл--магн. излучения, либо при v = const менять расстояние между уровнями внеш. электрич. полем, давлением, изменением темп-ры.

Определение симметрии парамагнитного центра . Угл. зависимость H р (q, f) отражает симметрию спинового гамильтониана, к-рая в свою очередь связана с симметрией парамагн. центра. Это даёт возможность по виду ф-ции H р (q, f), найденной экспериментально, определять симметрию центра. В случае высокосимметричных групп (О h , T d , C 4u , и др.) функция H р (q, f) обладает рядом характерных особенностей: 1) положения экстремумов для линий разных переходов совпадают; 2) расстояние между экстремумами равно p/2 (эффект ортогональности); 3) ф-ция H р симметрична относительно положений экстремумов и др. В случае низкосимметричных групп (C 1 , C 2 , C 3 и др.) все эти закономерности нарушены (эффекты низкой симметрии). Эти эффекты используются для определения структуры дефектов.

Обычному ЭПР соответствует спиновый гамильтониан, не учитывающий электрич. полей (=0). В него входят лишь операторы момента кол-ва движения и магн. поля. В силу их псевдовекторной природы макс. число несовпадающих спиновых гамильтонианов будет равно 11 (из 32 возможных точечных групп). Это приводит к неоднозначности в определении симметрии парамагн. центров, к-рую можно устранить, используя внеш. электрич. поле. Линейный по E оператор различен для разных точечных групп, не обладающих центром инверсии (для инверсионных центров =0). На 1-м этапе из экспериментов без поля E определяется совокупность групп с одним и тем же гамильтонианом, соответствующая симметрии спектра обычного ЭПР. На 2-м этапе используется поле E и учитывается то обстоятельство, что в каждую совокупность групп входит лишь одна группа с центром инверсии.

Исследование неупорядоченных систем . Наряду с изучением парамагн. центров в совершенных кристаллах ЭПР применяют и для исследования неупорядоченных систем (порошки, стёкла, растворы, кристаллы с дефектами). Особенностью таких систем является неодинаковость (неоднородность) условий в местах расположения центров из-за различий во внутр. электрич. (магн.) полях и деформациях, вызванных структурными искажениями кристалла; неэквивалентности ориентации парамагн. центров по отношению к внеш. полям; неоднородности последних. Это приводит к разбросу параметров спинового гамильтониана и как следствие к неоднородному уширению линий ЭПР. Изучение этих линий позволяет получить информацию о характере и степени дефектности кристалла. Неоднородное уширение любой природы можно рассматривать с единой точки зрения. Общее выражение для формы линии имеет вид:

где y - функция, описывающая исходную форму линии без учёта возмущающих факторов; V (F) - вероятность перехода в единицу времени; r(F ) - ф-ция распределения параметров F(F 1 , F 2 , .·., F k) , характеризующих механизмы уширения (компоненты полей, деформаций, углы). Так, в случае хаотически ориентированных парамагн. центров (порошки) под F следует понимать углы Эйлера, характеризующие ориентацию частицы порошка по отношению к системе координат, связанной с внеш. полями. На рис. 2 приведён типичный спектр ЭПР порошка для спинового гамильтониана вида Вместо угл. зависимости одиночной узкой линии, присущей парамагн. центрам в монокристаллах, в этом случае возникает ориентационно уширенная огибающая линия.

Рис. 2. Сигнал электронного парамагнитного резонан са хаотически ориентированных парамагнитных центров. Линия поглощения (а ) и её производная (б ) в случае ромбической симметрии спинового гамильто ниана. Характерные точки спектра связаны с параметрами спинового гамильтониана соотношением H pi =w/bg iii .

Релаксационные процессы . ЭПР сопровождается процессами восстановления нарушенного эл--магн. излучением равновесия в среде, соответствующего распределению Больцмана. Эти релаксац. процессы обусловлены связью между парамагн. центром и решёткой, а также центров между собрй. Соответственно различают с п и н-р е ш ё-т о ч н у ю и с п и н-с п и н о в у ю релаксации. Если переходы под действием эл--магн. волны преобладают, наступает явление насыщения (выравнивание населённостей уровней), проявляющееся в уменьшении сигнала ЭПР. Релаксац. процессы характеризуются временами релаксации и описываются кинетич. ур-ниями (см. Кинетическое уравнение основное) . В случае двух уровней i и j ур-ния для населённостей n i и n j - имеют вид

где a = u 0 ij + u ij , b = u 0 ji + u ji , u 0 ij и u ij -вероятности перехода в единицу времени с уровня i на уровень j под действием эл--магн. волны и релаксац. механизмов соответственно ( u 0 ij = u 0 ji) . Время релаксации T р определяется выражением T p = (u ij +u ji ) -1 и характеризует скорость установления равновесия. Релаксац. процессы, определяя времена жизни частиц на спиновых уровнях, приводят к их уширению, что сказывается на ширине и форме линии ЭПР. Это уширение, к-рое одинаковым образом проявляется у всех парамагн. центров, принято называть однородным. Оно определяет, в частности, ф-цию y, входящую в (3).

Двойные резонансы . Для описания спиновой системы введено понятие с п и н о в о й т е м п е р а т у р ы Т s . Определяющая распределение Больцмана связь между населённостью уровней и темп-рой обобщена на случай неравновесных населённостей. Из неё при произвольных соотношениях населённостей верх. (п в )и ниж. (n н) уровней следует, что Т s =-()/ln(n в /n н). При n в = n н (насыщение) T s = ,а при n в >n н величина T s < 0. Возможность создания неравновесной населённости и, в частности, ситуаций, при к-рых T s = и T s <0, привело к развитию двойных резонансов на базе ЭПР. Они характеризуются тем, что при наличии многоуровневой системы осуществляются резонансные переходы одновременно (или в опре-дел. последовательности) на двух частотах (рис. 3). Цель осуществления двойных резонансов: увеличение интенсивности поглощения за счёт увеличения разности населённостей (рис. 3, а); получение источника эл--магн. излучения путём создания на верхнем уровне большей населённости, чем на нижнем (рис. 3, б) . Принцип усиления сигнала лёг в основу реализации ряда двойных резонансов в случаях, когда в системе имеются спины разных сортов. Так, при наличии электронных и ядерных спинов возможен двойной э л е к т р о н н о-я д е рн ый р е з о н а н с (ДЭЯР). Сверхтонкое расщепление уровней обычно значительно меньше зеемановского. Это создаёт возможность усиливать переходы между сверхтонкими подуровнями путём насыщения спин-электронных переходов. В методе ДЭЯР повышается не только чувствительность аппаратуры, но и её разрешающая способность, т. к. сверхтонкие взаимодействия с каждым ядром можно наблюдать непосредственно в соответствующем спин-ядерном переходе (в то время как анализ сверхтонкой структуры по спектру ЭПР во многих случаях затруднён из-за перекрывания линий). Благодаря этим преимуществам ДЭЯР нашёл широкое применение в физике твёрдого тела, и в частности в физике полупроводников. С его помощью удаётся проанализировать ядра многих координац. сфер вблизи дефекта, что позволяет однозначно определить ею природу и свойства. Двойные резонансы, связанные с получением источников эл--магн. излучения, легли в основу работы квантовых генераторов, что привело к созданию и развитию нового направления - квантовой электроники.

Рис. 3. Двойной резонанс в многоуровневой системе . Выделены 3 уровня, для которых и n 1 0 - n 0 2 >>п 0 2 - п 0 3 (п 0 -равновесное значение); а - усиление поглощения; интенсивным электромагнитным излучением насыщаются уровни 1 и 2, так что n 1 n 2 = (n 0 1 + n 0 2)/2; в результате п 2 - п 3 увеличивается на (n 0 1 - n 0 2 )/ 2, и сигнал поглощения на частоте v 32 резко возрастает; б -мазерный эффект; насыщение уровней 1 и 3 приво дит к необходимому условию [n 3 -n 2 (n 0 1 -n 0 2)/2>0] для генерирования эл--магн. излучения на частоте v 32 ·

Заключение . ЭПР нашёл широкое применение в разл. областях физики, химии, геологии, биологии, медицине. Интенсивно используется для изучения поверхности твёрдых тел, фазовых переходов, неупорядоченных систем. В физике полупроводников с помощью ЭПР исследуются мелкие и глубокие точечные примесные центры, свободные носители заряда, носитель-примесные пары и комплексы, радиац. дефекты, дислокации, структурные дефекты, дефекты аморфизации, межслойные образования (типа границ Si - SiO 2), изучаются носитель-примесное взаимодействие, процессы рекомбинации, фотопроводимость и др. явления.

Лит.: Альтшулер С. А., Козырев Б. M., Электронный парамагнитный резонанс соединений элементов промежуточных групп, 2 изд., M., 1972; Пул Ч., Техника ЭПР-спектроскопии, пер. с англ., M., 1970; Абрагам А., Блини Б., Электронный парамагнитный резонанс переходных ионов, пер. с англ., г. 1-2, M., 1972-73; Мейльман M. Л., Самойлович M. И., Введение в спектроскопию ЭПР активированных монокристаллов, M., 1977; Электрические эффекты в радиоспектроскопии, под ред. M. Ф. Дей-гена, M., 1981; Ройцин А. Б., Маевский В. H., Радиоспектроскопия поверхности твердых тел, К., 1992; Радиоспектроскопия твердого тела, под ред. А. Б. Ройцина, К., 1992. А. Б. Ройцин .

ВВЕДЕНИЕ……………………………………………………………………….2

1.ПРИНЦИП МЕТОДА ЭПР…………………………………………………..3

1.1. История открытия метода ЭПР……………………………………………..3

1.2. Механический и магнитный моменты электрона…………………………4

1.3. Эффект Зеемана…………...............................................................................6

1.4. Основное уравнение резонанса……………………………………………8

2. ХРАКТЕРИСТИКА СПЕКТРОВ ЭПР ………………………………….10

2.1. Амплитуда сигнала, форма линии и ширина линии…………………….10

2.2. Сверхтонкая структура спектров ЭПР………………………………….16

……………………………………………………………..18

3.УСТРОЙСТВО РАДИОСПЕКТРОМЕТРА ЭПР……………………...22

4.ПРИМЕНЕНИЕ ЭПР В МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ………………………………………………………….24

4.1.Сигналы ЭПР, наблюдаемые в биологических системах………………..24

4.2. Метод спиновых меток и зондов…………………………………………26

4.3. Метод спиновых ловушек………………………………………………...35

ЗАКЛЮЧЕНИЕ……………………………………………………………...39

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ИСТОЧНИКОВ………………………..40

ВВЕДЕНИЕ

Электронный парамагнитный резонанс (ЭПР, электронный спиновый резонанс), явление резонансного поглощения электромагнитного излучения парамагнитными частицами, помещенными в постоянное магнитное поле, обусловленное квантовыми переходами между магнитными подуровнями парамагнитных атомов и ионов (эффект Зеемана). Открыт Завойским Евгением Константиновичем в Казанском государственном университете в 1944 г.

В отсутствие постоянного магнитного поля Н магнитные моменты неспаренных электронов направлены произвольно, состояние системы таких частиц вырождено по энергии. При наложении поля Н проекции магнитных моментов на направление поля принимают определенные значения и вырождение снимается (эффект Зеемана), т. е. происходит расщепление уровня энергии электронов E 0 .

Так как на нижнем уровне число электронов больше в соответствии с распределением Больцмана, то преимущественно будет происходить резонансное поглощение энергии переменного магнитного поля (его магнитной составляющей).

Для непрерывного наблюдения поглощения энергии условия резонанса недостаточно, т.к. при воздействии электромагнитного излучения произойдет выравнивание заселенностей подуровней (эффект насыщения). Для поддержания больцмановского распределения заселенностей подуровней необходимы релаксационные процессы.

Основные параметры спектров ЭПР - интенсивность, форма и ширина резонансной линии , g-фактор, константы тонкой и сверхтонкой (СТС) структуры.

1.ПРИНЦИП МЕТОДА ЭПР

1.1.История открытия метода ЭПР

Метод электронного парамагнитного резонанаса (ЭПР, EPR – electron paramagnetic resonance , ESR – electron spin resonance ) является основным методом для изучения парамагнитных частиц. К парамагнитным частицам имеющим важное биологическое значение относятся два основных типа – это свободные радикалы и комплексы металлов переменной валентности (таких как Fe, Cu, Co, Ni, Mn).

Метод электронного парамагнитного резонанса был открыт в 1944 г. Е.К. Завойским при исследовании взаимодействия электромагнитного излучения микроволнового диапазона с солями металлов. Он заметил, что монокристалл CuCl2, помещенный в постоянное магнитное поле 40 Гаусс (4 мТл), может поглощать излучение с частотой около 133 Мгц.

Пионерами применения ЭПР в биологических исследованиях в СССР были Л.А. Блюменфельд и А.Э. Калмансон, которые начали изучать свободные радикалы белков, полученные под действием ионизирующего излучения.

Со временем, синтез стабильных нитроксильных радикалов существенно расширил область применения метода ЭПР в биологических и медицинских исследованиях. Сегодня этот метод является одним из широко используемых методов современной науки.

1.2. Механический и магнитный моменты электрона

В основе метода ЭПР лежит поглощение электромагнитного излучения радиодиапазона неспаренными электронами, находящимися в магнитном поле.

Хорошо известно, что электрон в атоме участвует в орбитальном и спиновом движении, которые можно охарактеризовать с помощью соответствующих механических и магнитных моментов. Так, орбитальный магнитный момент связан с механическим выражением

(1)

где -магнитный орбитальный момент, а -механический орбитальный момент. В свою очередь механический орбитальный момент может быть выражен через орбитальное квантовое число

(2)

Подставив выражение (1.2) в (1.1) получим, что

Величина является элементарным магнитным моментом и носит название –магнетон Бора для электрона. Она обозначается буквой β и равна 9,27·10–24 Дж/Тл.

Для спинового магнитного момента можно написать аналогичные выражения

(4)

(5)

(6)

где – спиновый магнитный момент, Ps – механический магнитный момент, а s –спиновое квантовое число. Важно отметить, что коэффициент пропорциональности между и Ps (e/m ) вдвое больше, чем для и Pl (e/2m ).

В итоге полный магнитный момент электрона, являющийся вектором, будет равен сумме векторов орбитального и спинового магнитных моментов

(7)

Поскольку абсолютные значения и могут сильно отличаться, то для удобства учета вклада орбитального и спинового магнитных моментов в суммарный магнитный момент электрона вводят коэффициент пропорциональности, показывающий долю каждого из моментов в полном магнитном моменте – величину g или g -фактор.

где Pj – полный механический момент электрона, равный Pl + Ps . g -Фактор равен единице при s = 0 (т.е. при отсутствии спинового движения) и равен двум, если орбитальный момент равен нулю (l = 0). g -Фактор идентичен фактору спектроскопического расщепления Ланде и может быть выражен через полные квантовые числа S , P и J :

где (9)

Поскольку в большинстве случаев электронные орбитали сильно отличаются от сферических, то орбитальный магнитный момент дает относительно небольшой вклад в суммарный магнитный момент. Для упрощения вычислений этим вкладом можно пренебречь. Кроме того, если заменить спиновый механический момент его проекцией на выделенное направление (например, на направление магнитного поля), то мы получим следующее выражение:

(10)

где eh/4πm – магнетон Бора, а – магнитное квантовое число, являющееся проекцией спинового магнитного момента на выделенное направление и равное ±1/2.

1 .3. Эффект Зеемана

Рисунок 1 – Ориентация электронов во внешнем магнитном поле (H ).

В отсутствие внешнего магнитного поля магнитные моменты электронов ориентированы случайным образом (рис.1 слева), и их энергия практически не отличается друг от друга (Е0). При наложении внешнего магнитного поля магнитные моменты электронов ориентируются в поле в зависимости от величины спинового магнитного момента (рис.1. справа), и их энергетический уровень расщепляется на два (рис.2).

Рисунок 2 – Расщепление энергетических уровней одиночных электронов в магнитном поле (эффект Зеемана).

Энергия взаимодействия магнитного момента электрона с магнитным полем выражается уравнением

(11)

где μ – суммарный магнитный момент электрона, Н – напряженность магнитного поля, а cos(μH) – косинус угла между векторами μ и Н.

В нашем случае энергия взаимодействия электрона с внешним магнитным полем составит величину

(12)

а разница в энергии между двумя уровнями составит

(13)

Таким образом энергетические уровни электронов, помещенных в магнитное поле, расщепляются в этом поле в зависимости от величины спинового магнитного момента и интенсивности магнитного поля (эффект Зеемана ) .

1.4.Основное уравнение резонанса

Количество электронов в изучаемой системе, имеющих ту или иную энергию, будет определяться в соответствии с распределением Больцмана, а именно

(14)

где и количество электронов на более высоком или более низком энергетическом уровне, соответствующем магнитному моменту электрона со спином +1/2 или –1/2.

Если на систему электронов, находящуюся в магнитном поле, падает электромагнитная волна, то при определенных значениях величины энергии падающих квантов будут происходить переходы электронов между уровнями.

Необходимое условие – равенство энергии падающего кванта (hν) и разности энергий между уровнями электронов с различными спинами (gβH).

ΔE = hν = gβH (15)

Это уравнение выражает основное условие поглощения энергии электронами и называется основным уравнением резонанса . Под влиянием излучения электроны, находящиеся на более высоком энергетическом уровне, будут испускать энергию и возвращаться на нижний уровень, это явление называется индуцированной эмиссией. Электроны же, находящиеся на нижнем уровне, будут поглощать энергию и переходить на более высокий

энергетический уровень, это явление называется резонансным поглощением . Поскольку вероятности одиночных переходов между энергетическими уровнями равны, а общая вероятность переходов пропорциональна количеству электронов, находящихся на данном энергетическом уровне, то поглощение энергии будет преобладать над ее излучением. Это связано с тем, что как следует из распределения Больцмана заселенность нижнего уровня выше заселенности верхнего энергетического уровня.

Следует помнить, что различие в уровнях энергии электрона в магнитном поле (а также и других заряженных частиц, обладающих спином, например, у протонов) связано с наличием у электрона собственного магнитного момента. У спаренных электронов магнитные моменты скомпенсированы, и они на внешнее магнитное поле не реагируют, поэтому обычные молекулы не дают сигналов ЭПР. Таким образом, ЭПР позволяет обнаруживать и изучать свойства свободных радикалов (имеющих неспаренный электрон на внешних орбиталях) и комплексов металлов переменной валентности (у которых неспаренный электрон принадлежит более глубоким электронным оболочкам). Эти две группы парамагнитных частиц часто называют парамагнитными центрами.

2.ХАРАКТЕРИСТИКА СПЕКТРОВ ЭПР

Метод ЭПР позволяет нам изучать свойства парамагнитных центров посредством спектров поглощения электромагнитного излучения этими частицами. Зная характеристики спектров можно судить и о свойствах парамагнитных частиц. К основным характеристикам спектров относятся амплитуда, ширина линии, форма линии, g -фактор и сверхтонкая структура спектров.

2.1. Амплитуда сигнала, форма линии и ширина линии

Амплитуда сигнала

Сигнал ЭПР представляет собой первую производную от спектра поглощения (рис. 3). Площадь под линией поглощения пропорциональна концентрации парамагнитных частиц в образце. Таким образом, концентрация парамагнитных центров пропорциональна первому интегралу под линией поглощения или второму интегралу от спектра ЭПР. Если два сигнала имеют одинаковую ширину, то концентрации парамагнитных центров соотносятся как амплитуды сигналов в спектрах поглощения.

Рисунок 3 - Сигнал ЭПР. Слева – зависимость поглощения СВЧ от напряженности магнитного поля (H); справа – первая производная этой зависимости. ЭПР-спектрометры регистрируют кривые второго типа.

Для определения концентрации измеряют площади под кривой поглощения у образца сравнения с известной концентрацией парамагнитных центров и у измеряемого образца и неизвестную концентрацию находят из пропорции, при условии, что оба образца имеют одинаковый объем:

(16)

где и – концентрации измеряемого образца и образца сравнения соответственно, а S x и S 0 – площади под линиями поглощения измеряемого сигнала и образца сравнения.

Для определения площади под линией поглощения неизвестного сигнала можно воспользоваться приемом численного интегрирования

(17)

где f "(H ) – первая производная линии поглощения (спектр ЭПР), F (H ) – функция линии поглощения, а H – напряженность магнитного поля.

(18)

Учитывая, что F (H ) . H в точках -∞ и ∞ равно нулю и dF (H ) равно f "(H ) dH , получим

(19)

где f "(H ) – первая производная от линии поглощения, или спектр ЭПР. От интеграла легко перейти к интегральной сумме, учитывая, что H = nΔH , получим

(20)

где Δ H – шаг изменения магнитного поля, а n i – номер шага. Таким образом, площадь под кривой поглощения будет равна произведению квадрата величины шага магнитного поля на сумму произведений амплитуды спектра ЭПР на номер шага. Из выражения (20) легко видеть, что при больших n (т.е. вдали от центра сигнала) вклад удаленных частей спектра может быть достаточно большим даже при малых значениях амплитуды сигнала.

Форма линии

Хотя согласно основному уравнению резонанса поглощение происходит только при равенстве энергии падающего кванта разности энергии между уровнями неспаренных электронов, спектр ЭПР является непрерывным в некоторой окрестности точки резонанса. Функция, описывающая сигнал ЭПР называется функцией формы линии. В разбавленных растворах, когда можно пренебречь взаимодействием между парамагнитными частицами, кривая поглощения описывается функцией Лоренца:

(21)

где – функция кривой поглощения в точке резонанса, – значение поля в точке резонанса,– ширина сигнала на половине высоты. Аналогичные обозначения используются для кривой поглощения, описываемой функцией Гаусса.

(22)

Функция Гаусса является огибающей спектра ЭПР если между парамагнитными частицами существует взаимодействие. Учитывать форму линии особенно важно при определении площади под кривой поглощения. Как видно из вышеприведенных формул у Лоренцевой линии более медленное убывание и соответственно более широкие крылья, что может давать значительную ошибку при интегрировании спектра.

Ширина линии

Ширина спектра ЭПР зависит от взаимодействия магнитного момента электрона с магнитными моментами окружающих ядер (решетки) (спин-решеточное взаимодействие) и электронов (спин-спиновое взаимодействие). В отсутствие этих взаимодействий энергия, поглощенная электронами, приводила бы к снижению разности заселенности уровней и прекращению поглощения.

Однако, в эксперименте изменения разности заселенности уровней не наблюдается благодаря тому, что существуют процессы, в которых поглощенная энергия передается окружению и электроны возвращаются на исходный уровень. Такие процессы называются процессами релаксации, они поддерживают постоянной разность заселенности энергетических уровней. Механизм релаксации заключается в передаче электромагнитной энергии кванта решетке или окружающим электронам и возвращении электрона на

низкоэнергетический уровень. Время, в течение которого электрон пребывает на высокоэнергетическом уровне, называется временем релаксации. Соответственно существует время спин-решеточной (Т 1) и спин-спиновой (Т 2) релаксации.

Одна из причин уширения полос поглощения в сигналах ЭПР кроется в волновых свойствах элементарных частиц, которые проявляются в существовании известного принципа соотношения неопределенностей Гейзенберга. Согласно этому принципу, чем точнее задано время наблюдения (чем меньше Δ t ), тем больше неопределенность в величине энергии частицы (:

(23)

Если принять, что Δ t это время релаксации T , а Δ Е соответствует g βΔ H , то мы получим, что

(24)

т.е. неопределенность в ширине линии обратно пропорциональна времени релаксации. Наблюдаемое время релаксации считают суммой времени спин-решеточной и спин-спиновой релаксации.

(25)

Свободные радикалы в растворах имеют Т1>> T 2, следовательно ширина линии будет зависеть в основном от Т2.

«Естественное» уширение сигнала ЭПР, зависящее от времени спин-решеточной и спин-спиновой релаксации – не единственный механизмам, влияющий на ширину линии c игнала. Важную роль играют также диполь-дипольное взаимодействие ; анизотропия g -фактора; динамическое уширение линии и спиновый обмен.

В основе диполь-дипольного взаимодействия лежит взаимодействие магнитного момента неспаренного электрона с локальным магнитным полем, создаваемым соседними электронами и ядрами. Напряженность магнитного поля в точке, где находится неспаренный электрон, зависит от взаимной ориентации магнитных моментов неспаренного электрона и другого электрона или ядра и расстояния между этими центрами. Изменение энергии неспаренного электрона определяется уравнением

(26)

где μ – магнитный момент электрона, θ – угол между взаимодействующими магнитными моментам R – расстояние между ними.

Вклад анизотропии g-фактора в уширение линии ЭПР связан с тем, что орбитальное движение электрона создает магнитное поле, с которым взаимодействует спиновый магнитный момент. Это создает сдвиг величины напряженности внешнего поля, при которой наблюдается резонанс, т.е. к сдвигу положения максимума сигнала ЭПР. В свою очередь, это проявляется в кажущемся отклонении g -фактора свободного электрона от значения 2,00. С другой стороны, влияние орбитального магнитного поля на электрон

зависит от ориентации молекулы по отношению к внешнему магнитному полю, что приводит к уширению сигнала ЭПР при измерении в системе, состоящей из множества хаотически ориентированных молекул.

Уширение сигнала ЭПР может быть связано также с взаимным превращением двух парамагнитных частиц. Так, если каждая из частиц имеет свой спектр ЭПР, то увеличение скорости взаимного превращения друг в друга будет приводить к уширению линий, т.к. при этом уменьшается время жизни радикала в каждом состоянии. Такое изменение ширины сигнала называется динамическим уширением сигнала.

Спиновый обмен является еще одной из причин уширения сигнала ЭПР. Механизм уширения сигнала при спиновом обмене заключается в изменении направления спинового магнитного момента электрона на противоположное при соударении с другим неспаренным электроном или иным парамагнетиком. Поскольку при таком соударении уменьшается время жизни электрона в данном состоянии, то опять-таки сигнал ЭПР уширяется. Наиболее частым случаем уширения линии ЭПР по механизму спинового обмена является уширение сигнала в присутствие кислорода или парамагнитных ионов металлов .

2.2 Сверхтонкая структура спектров ЭПР

В основе расщепления одиночной линии ЭПР на несколько лежит явление сверхтонкого взаимодействия , т. е. взаимодействия магнитных моментов неспаренных электронов () с магнитными моментами соседних ядер (

На рисунке 4 дано пояснение сверхтонкого взаимодействия. Неспаренный электрон в радикале может быть расположен близко к протону, например как в радикале этанола (1). В отсутствие влияния близлежащих протонов электрон имеет сигнал в форме одиночной линии (2). Однако протон также имеет магнитный момент, который ориентирован во внешнем магнитном поле (H 0) в двух направлениях (по полю либо против поля) потому, что, подобно электрону, имеет спиновое число S = ½. Будучи маленьким магнитом, протон создает магнитное поле, которое в месте расположения электрона имеет определенные значения +Hp или –Hp в зависимости от ориентации протона (3). В результате суммарное магнитное поле, приложенное к неспаренному электрону (4), имеет значение, немного большее (+ Hp) или немного меньшее (– Hp), чем в отсутствии протона (). Поэтому сигнал ЭПР радикала состоит из двух полос, расстояние от которых до прежнего центра полосы равно Hp (5).

Рисунок 4- Сверхтонкое расщепление сигнала ЭПР в радикале этанола.

1 – радикал этанола. 2 – сигнал ЭПР электрона во внешнем поле. 3 – ориентация протонов во внешнем магнитном поле. 4 – увеличение или уменьшение поля, действующего на электрон в результате наложения магнитного поля протона (H p) на внешнее магнитное поле. 5 – сигнал ЭПР радикала, в котором магнитное поле протона накладывается на внешнее магнитное поле.

В рассмотренном нами примере спин ядра, взаимодействующего с неспаренным электроном, был равен ± 1/2, что в конечном итоге дало нам расщепление на две линии. Такая величина спина характерна для протонов. У ядер атомов азота (N14) спин целочисленный . Он может принимать значения ±1 и 0. В этом случае при взаимодействии неспаренного электрона с ядром атома азота будет наблюдаться расщепление на три одинаковых линии, соответствующих величине спина +1, –1 и 0. В общем случае число

линий в спектре ЭПР равно 2 m N+1. (см. далее, рис.10)

Естественно, что количество неспаренных электронов и соответственно площадь под кривой поглощения ЭПР не зависят от величины спина ядра и являются постоянными величинами. Следовательно, при расщеплении одиночного сигнала ЭПР на два или три, интенсивность каждой компоненты будет соответственно в 2 или 3 раза ниже.

Очень похожая картина возникает, если неспаренный электрон взаимодействует не с одним, а с несколькими эквивалентными (с одинаковой константой сверхтонкого взаимодействия) ядрами, имеющими магнитный момент отличный от нуля, например двумя протонами. В этом случае возникает три состояния, соответствующие ориентации спинов протонов: (а) оба по полю, (б) оба против поля и (в) один по полю и один против поля. Вариант (в) имеет вдвое большую вероятность, чем (а) или (б), т.к. может быть осуществлен двумя способами. В результате такого распределения неспаренных электронов одиночная линия расщепится на три с соотношением интенсивностей 1:2:1. В общем случае, для n эквивалентных ядер со спином mN число линий равно n 2 m N +1.

2.3. Свойства атомов с магнитными ядрами, константы, СТВ неспаренного электрона с ядром

В -электронных системах (большинство органических свободных радикалов) спиновая плотность в точке ядра равна нулю (узловая точка р-орбитали) и реализуются два механизма возникновения СТВ (спинового переноса): конфигурационное взаимодействие и эффект сверхсопряжения. Механизм конфигурационного взаимодействия иллюстрируется рассмотрением СН-фрагмента (рис. 5). Когда на р-орбитали появляется неспаренный электрон , его магнитное поле взаимодействует с парой электронов -связи С — Н так, что происходит их частичное распаривание (спиновая поляризация), в результате чего на протоне появляется отрицательная спиновая плотность , поскольку энергии взаимодействия спинов и различны. Состояние, указанное на рис. 5, а, более устойчиво, так как для углеродного атома , несущего неспаренный электрон , в соответствии с правилом Хунда реализуется максимальная мультиплетность . Для систем этого типа существует связь между константой СТВ с протоном и спиновой плотностью на соответствующем углеродном атоме , определяемая соотношением Мак-Коннела: где Q = -28 x 10 -4 Тл, - спиновая плотность на атоме углерода . Спиновый перенос по механизму конфигурационного взаимодействия реализуется для ароматических протонов и -протонов в органических свободных радикалах.

Рисунок 5 - Возможные спиновые конфигурации для -орбитали, связывающей атом водорода во фрагменте С — Н, и р-орбитали атома углерода со спином а - спины на связывающей -орбитали и р-орбитали атома углерода параллельны, б - те же спины антипараллельны.

Эффект сверхсопряжения заключается в непосредственном перекрывании орбиталей неспаренного электрона и магнитных ядер. В частности, в алкильных радикалах СТВ по этому механизму возникает на ядрах -протонов. Например, в этильном радикале на -протонах СТВ определяется конфигурационным взаимодействием, а на -протонах - сверхсопряжением. Эквивалентность СТВ с тремя протонами метильной группы в рассматриваемом случае обусловлена быстрым вращением группы СН 3 относительно связи С — С. В отсутствие свободного вращения (или в случае затрудненного вращения), что реализуется в жидкой фазе для множества систем с разветвленными алкильными заместителями или в монокристаллических образцах, константа СТВ с -протонами определяется выражением , где - двугранный угол между 2р z -орбиталью -углеродного атома и связью СН, В 0 4 x 10 -4 Тл определяет вклад спиновой поляризации по ядерному остову (конфигурационное взаимодействие), B 2 45 x 10 -4 Тл. В пределе быстрого вращения а н = 2,65 x 10- 3 Тл. В спектроскопии ЭПР триплетных состояний (S=1) помимо электрон-ядерных взаимодействий (СТВ) необходимо учитывать взаимодействие неспаренных электронов друг с другом. Оно определяется диполь-дипольным взаимодействием, усредняемым до нуля в жидкой фазе и описываемым параметрами нулевого расщепления D и E, зависящими от расстояния между неспасенными электронами (радикальные пары), а также обменным взаимодействием (изотропным), обусловленным непосредственным перекрыванием орбиталей неспаренных электронов (спиновый обмен), которое описывается обменным интегралом J обм . Для бирадикалов , в которых каждый из радикальных центров имеет одно магнитное ядро с константой СТВ на этом ядре а, в случае быстрого (сильного) обмена J обм а, и каждый неспаренный электрон бирадикальной системы взаимодействует с магнитными ядрами обоих радикальных центров. При слабом обмене (J обм а) регистрируются спектры ЭПР каждого радикального центра независимо, то есть фиксируется "монорадикальная" картина. Зависимость J обм от т-ры и растворителя позволяет получить динамические характеристики бирадикальной системы (частоту и энергетический барьер спинового обмена) .

1. УСТРОЙСТВО РАДИОСПЕКТРОМЕТРА ЭПР

Устройство радиоспектрометра ЭПР лишь весьма отдаленно напоминает устройство спектрофотометра для измерения оптического поглощения в видимой и ультрафиолетовой частях спектра (рис. 6).

Рисунок 6 – Устройство ЭПР спектрометра.

Источником излучения в радиоспектрометре является клистрон, представляющий из себя радиолампу, дающую монохроматическое излучение в диапазоне сантиметровых волн.

Роль диафрагмы в радиоспектрометре выполняет аттенюатор, позволяющий дозировать мощность, падающую на образец. Кювета с образцом в радиоспектрометре находится в специальном блоке, называемом резонатором. Резонатор представляет собой изготовленный из металла полый параллелепипед, полость которого имеет цилиндрическую или прямоугольную форму. В ней находится поглощающий образец. Размеры резонатора таковы, что входящее излучение образует в нем стоячую электромагнитную волну. Элементом, полностью отсутствующим в оптическом спектрометре, является электромагнит, создающий постоянное магнитное поле, необходимое для расщепления энергетических уровней электронов. Излучение, прошедшее измеряемый образец, попадает на детектор, затем сигнал детектора усиливается и регистрируется на самописце или компьютере. Своеобразие конструкции радиоспектрометра заключается в том, что излучение радиодиапазона передается от источника к образцу и далее к детектору с помощью специальных трубок прямоугольного сечения, служащих волноводами. Размеры сечения волноводов определяются длиной волны передаваемого излучения. Эта особенность передачи радиоизлучения по волноводам и определяет тот факт, что для регистрации спектра ЭПР в радиоспектрометре используется постоянная частота излучения, а условие резонанса достигается изменением величины магнитного поля.

Еще одной важной особенностью радиоспектрометра является то, что этот прибор измеряет не поглощение (A) электромагнитных (свч) волн, а первую производную поглощения по напряженности магнитного поля dA/dH. Дело в том, что для измерения поглощения нужно сравнивать интенсивности прошедшего излучения у измеряемого и контрольного объекта (скажем, пустой кюветы), а при измерении первой производной контрольный объект не нужен. При изменении магнитного поля интенсивность свч волн, прошедших через пустое пространство или непоглощающий объект, не изменяется и первая производная поглощения равна нулю. Если же свч волны проходят через объект с парамагнитными центрами, то поглощение имеет место, а его величина зависит от напряженности магнитного поля. Изменяем поле и изменяется поглощение, что проявляется в изменении интенсивности измеряемого свч колебания. Именно это изменение интенсивности измеряемого свч при небольшой модуляции магнитного поля около заданной его величины позволяет определять dA/dH в каждой точке H, получая тем самым спектры, или сигналы ЭПР .

1. ПРИМЕНЕНИЕ ЭПР В МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ

1. Сигналы ЭПР, наблюдаемые в биологических системах

Применение метода ЭПР в биологических исследованиях связано с изучением двух основных видов парамагнитных центров – свободных радикалов и ионов металлов переменной валентности. Изучение свободных радикалов в биологических системах связано с трудностью, заключающейся в низкой концентрации свободных радикалов, образующихся при жизнедеятельности клеток. Концентрация радикалов в нормально метаболизирующих клетках составляет по разным источникам примерно М, в то время как современные радиоспектрометры позволяют измерять концентрации радикалов М. Повысить концентрацию свободных радикалов можно затормозив их гибель или повысив скорость их образования. В условиях эксперимента образование

радикалов легче всего наблюдать при облучении биологических объектов при очень низкой температуре (скажем 77К) в ходе их облучения УФ или ионизирующей радиацией. Изучение структуры радикалов более или менее сложных биологически важных молекул, полученных в таких условиях, и было одним из первых направлений применения метода ЭПР в биологических исследованиях (рис.7). Вторым направлением применения метода ЭПР в биологических исследованиях было изучение металлов переменной валентности и/или их комплексов, существующих in vivo . Из-за коротких времен релаксации сигналы ЭПР металлопротеинов тоже можно наблюдать только при низкой температуре, например, температуре жидкого азота или даже гелия.

Рисунок 7 - Спектры ЭПР УФ-облученного цистеина при температуре жидкого азота (77 К) и обычной температуре (300 К).

В качестве примера на рис. 8 дан спектр ЭПР печени крысы. На нем можно увидеть сигналы цитохрома Р-450, имеющие g -фактор 1,94 и 2,25, сигнал метгемоглобина с g - фактором 4,3 и сигнал свободных радикалов, принадлежащий семихинонным радикалам аскорбиновой кислоты и флавинов с g -фактором 2,00.

Рисунок 8 - Спектр ЭПР печени крысы.

Впрочем, сигналы ЭПР некоторых радикалов можно наблюдать и при комнатной температуре. К таким сигналам относятся сигналы ЭПР многих семихинонных или феноксильных радикалов, таких как семихинонный радикал убихинона, феноксильный и семихинонный радикал α-токоферола (витамина Е), витамина D, и многие другие (рис.9).

Рисунок 9 - Сигналы ЭПР семихинонных и феноксильных радикалов.

1. Метод спиновых меток и зондов

Важным этапом в развитии применения метода ЭПР в биологических исследованиях стал синтез стабильных свободных радикалов. Среди таких радикалов наибольшую популярность получили нитроксильные радикалы.

Стабильность нитроксильных радикалов обусловлена пространственным экранированием группы N–O . , имеющей неспаренный электрон, четырьмя метильными группами, препятствующими протеканию реакции с участием свободной валентности. Однако, такая экранировка не является абсолютной и реакция восстановления свободной валентности все-таки может происходить. Аскорбиновая кислота, например, является хорошим восстановителем нитроксильных радикалов.

Спектр ЭПР нитроксильных радикалов обычно состоит из трех линий равной интенсивности, благодаря взаимодействию неспаренного электрона с ядром атома азота (рис.10).

Рисунок 10 - Формула и спектр ЭПР нитроксильного радикала 2,2,6,6-

тетраметил-пиперидин-1-оксил (ТЕМПО).

Оставим в стороне непростую теорию, объясняющую зависимость формы сигнала ЭПР от подвижности зонда и ограничимся весьма схематическим изложением того, что наблюдается в опытах. Если нитроксильный радикал находится в водном растворе, то его вращение является изотропным и достаточно быстрым, при этом наблюдается сигнал ЭПР, состоящий из трех узких симметричных линий (рис. 11, вверху). При уменьшении скорости вращения наблюдается уширение линий и изменению амплитуды компонент спектра (рис. 11, в середине). Дальнейшее увеличение вязкости среды приводит к еще большему изменению сигнала ЭПР спинового зонда (рис. 11, внизу).

Для количественного описания вращательного движения радикала используют понятие времени вращательной корреляции (τс). Оно равно времени поворота нитроксильного радикала на угол π/2. На основании анализа сигнала ЭПР время корреляции можно оценить, используя эмпирическое уравнение

(27)

Где Δ– ширина полосы спектра ЭПР при низком значении поля, а и –интенсивность высокопольной и низкопольной компоненты спектра ЭПР. Это уравнение можно использовать при времени корреляции от 5·до с.

Синтез стабильных нитроксильных радикалов семейства ТЕМПО был важным этапом в использовании метода ЭПР для изучения внутренней вязкости биологических мембран и белков решению медико-биологических задач.

Рисунок 11 - Спектр ЭПР ТЕМПО при разных временах вращательной корреляции τс (цифры слева от спектров ).

Однако производные ТЕМПО, имеют, к сожалению, один существенный недостаток - вследствие их амфифильности трудно бывает определить локализацию этого зонда и таким образом ответить на вопрос, где мы, собственно говоря, определяем микровязкость. Эта проблема была практически решена, когда появились так называемые «жирнокислотные спиновые зонды», т.е. соединения, в которых молекула нитроксильного радикала была ковалентно присоединена к молекуле жирной кислоты. В этом случае спектр ЭПР несомненно отражает свойства именно гидрофобной (липидной) фазы изучаемой системы, куда встаивается зонд. На рисунке 12 приведено схематическое строение молекулы жирнокислотного спинового зонда, 5-доксилстеарата, в которой нитроксильный радикал (доксил, соединение родственное ТЕМПО по структуре) присоединен к 5 атому углерода молекулы стеариновой кислоты. Характеристикой движения такого зонда служит величина, называемая параметром упорядоченности S , который характеризует степень асимметрии вращания зонда относительно продольной и поперечной осей его молекулы. Найти параметр упорядоченности можно из характеристик спектра ЭПР по эмпирическому уравнению

(28)

где A|| и A ⊥ – параметры, указанные на рисунке. Теоретически, параметр упорядоченности может изменяться от 0 до 1, с изменением вязкости и структурированности мембраны. При совершенно симметричном вращении, когда скорость вращения вокруг трех осей одинакова (что характерно для сферических частиц в изотропной среде), параметр упорядоченности равен нулю. Параметр упорядоченности равен 1, если ось вращения зонда совпадает с нормалью к мембране, а вращение относительно иных осей полностью отсутствует. При низких температурах или в мембранах из синтетических насыщенных фосфолипидов, вращение зонд вращается преимущественнол вокруг длинной оси молекулы, ориетированной поперек мембраны. При этом параметр упорядоченности имеет высокие значсения. При уменьшении вязкости мембраны значение параметра упорядоченности уменьшается.

Рисунок 12 – Химическая формула и спектр ЭПР 5 – доксилстеарата.

Очень ценным качеством спиновых зондов, содержащих жирную кислоту, является возможность измерения с их помощью параметра упорядоченности на разном расстоянии от поверхности мембраны, так называемого профиля упорядоченности или профиля вязкости. Для этого используют набор спиновых зондов, которые представляют собой молекулы одной и той же жирной кислоты, которые содержат нитроксильный фрагмент на разном расстоянии от карбоксильной группы. Например, используются спиновые зонды с нитроксильным радикалом у 5, 7, 12 и 16 атома углерода стеариновой кислоты. Набор этих соединений позволяет измерять параметр S на расстоянии 3,5, 5, 8,5 и 10,5 ангстрем от поверхности мембраны (рис.13).

Рисунок 13- Изменение сигнала ЭПР при удалении нитроксильного радикала от полярной карбоксильной группы жирной кислоты.

Обычно спектры ЭПР спинового зонда, включенного в мембрану, и зонда, находящегося в окружающем водном растворе, могут существенно различаться. Это свойство было использовано для создания нового класса спиновых зондов, позволяющих измерять межфазный потенциал мембраны (часто называемый поверхностным потенциалом). Для измерения этого потенциала измеряют коэффициент распределения вода/мембрана нейтрального и заряженного зондов. Поскольку заряженный зонд взаимодействует с зарядами, расположенными на поверхности мембраны, то его коэффициент распределения будет отличаться от такового у нейтрального зонда. Отношение коэффициентов распределения служит мерой поверхностного потенциала изучаемой мембраны. Химическая формула спинового зонда, используемого для измерения поверхностного потенциала приведена на рис.14 .

Рисунок 14 - Химическая формула заряженного спинового зонда.

Еще одним важным применением метода спинового зонда является измерение рН в микрообъемах, например, внутри лизосом или фагосом клеток. Для этих целей применяют специальные рН-чувствительные спиновые зонды (рис. 15). В основе метода рН-метрии с применением спиновых зондов лежит способность зонда давать разные спектры ЭПР в

протонированной и депротонированной формах. Таким образом, в зависимости от рК спинового зонда, существует некоторый диапазон рН в котором и происходит его протонирование и соответствующее изменение спектра ЭПР (рис.16).

Рисунок 15 - Химические формулы рН-чувствительного спинового зонда.

Рисунок 16 - Спектры ЭПР и и зависимость концентрации депротонированного рН- чувствительного спинового зонда от рН

Все о чем до сих пор говорилось в данном разделе касалось метода спиновых зондов . Однако не менее интересным является и метод спиновых меток . В основе метода спиновых меток лежит тот же принцип изменения спектра ЭПР нитроксильного радикала в зависимости от скорости и изотропности его вращения. Отличием же метода является тот факт, что спиновая метка ковалентно связывается с другой более или менее крупной

молекулой.

Одним из первых и удачных применений метода спиновой метки было измерение количества и доступности SH-групп белков (рис.17). Химическая формула и спектр ЭПР спиновой метки, взаимодействующей с сульфгидрильными группами, в свободном состоянии и после присоединения к белку приведены на рис.18.

Рисунок 17 - Схема взаимодействия спинового зонда с тиоловой группой белка.

Из рисунка можно видеть, что спектры ЭПР спиновой метки в свободном и связанном состоянии сильно отличаются, что связано с различием в скорости и направлении вращения. Естественно, что связанная спиновая метка имеет значительно более низкую скорость вращения, чем в свободном виде. Более того, количество связанных спиновых меток и соответственно интенсивность сигнала ЭПР пропорциональны количеству

прореагировавших со спиновой меткой сульфгидрильных групп, что позволяет определять не только подвижность зонда, но и его количество.

Рисунок 18 - Химическая формула спиновой метки для SH-групп и спектры ЭПР иммобилизованной (1), связанной (2) и свободной (3) спиновой метки.

В настоящее время существует множество методических приемов, позволяющих изучать топографию белковой глобулы с использованием спиновых меток. Поскольку многие ионы металлов переменной валентности являются парамагнетиками и кроме того могут находиться в активном центре фермента, то взаимодействие спиновой метки, прикрепленной, например, к остатку цистеина или гистидина белковой глобулы, с ионом металла будет приводить к уширению спектра ЭПР в результате диполь-дипольного взаимодействия парамагнетиков .

1. Метод спиновых ловушек

Появление нитроксильных радикалов оказалось решающим событием в решении проблемы обнаружения и исследования свободных радикалов, образующихся в живых системах. Обнаружение радикалов оказалось возможным благодаря появлению метода

спиновых ловушек. Суть метода заключается в том, что некоторое соединение, не являющееся нитроксильным радикалом, но имеющее структуру близкую к нитроксильному радикалу (спиновая ловушка ), взаимодействует со свободным, короткоживущим радикалом и превращается в долгоживущий нитроксильный радикал (спиновый аддукт ), спектр ЭПР которого, уникален для данного радикала или семейства радикалов.

По химической природе спиновые ловушки можно отнести к двум основным классам – это нитроны и нитрозосоединения. К нитронам относятся две наиболее популярные спиновые ловушки – С-фенил-N-трет-бутил нитрон (ФБН) и 5,5-диметил-пирролин-1- оксил (ДМПО). Реакция взаимодействия ФБН с радикалом выглядит следующим образом:

Стабильность образующегося нитроксильного радикала ФБН (спинового аддукта ) объясняется тем, что атом кислорода, на котором локализован неспаренный электрон, пространственно экранирован тремя метильными группами. Спиновый аддукт радикала обладает уникальным спектром ЭПР (см. рис.19). При этом форма спектров ЭПР спиновых аддуктов зависит от природы присоединившегося свободного радикала. Таким образом удается проводить исследование свободнорадикальных реакций в биологических объектах методом ЭПР при физиологических температурах.

Рисунок 19 - Спектр ЭПР спинового аддукта и значения констант сверхтонкого расщепления для некоторых радикалов.

aH и aN – константы сверхтонкого расщепления на протоне и атоме азота соответственно

Рисунок 20 – Схема реакции ловушки ДМПО и ОН радикала.

На рис. 20 показана реакция другой спиновой ловушки, ДМПО с гидроксильным радикалом и образование спинового аддукта этого радикала. Опять-таки, измеряя константы сверхтонкого расщепления спектра спинового аддукта можно идентифицировать короткоживущий радикал .

Метод спиновых ловушек занимает одно из важнейших мест в медико-биологических исследованиях, т.к. позволяет обнаруживать и идентифицировать радикалы, образующиеся в живых клетках и тканях. Среди таких радикалов следует отметить супероксидный и гидроксильный радикалы, а также оксид азота. Кроме того, применение метода спиновых ловушек дает возможность иучать антиоксидантные свойства веществ и величину антиоксидантного резерва .

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Метод электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) основан на взаимодействии вещества с магнитным полем. Как следует из названия метода, он применяется для исследования парамагнитных частиц.

Известно, что при помещении парамагнетиков в магнитное поле, парамагнетик втягивается в это поле. Это связано с наличием у парамагнетиков магнитных моментов.Магнитные моменты создаются неспаренными электронами.

Примерами парамагнитных частиц, представляющих интерес для биологов, служат свободные радикалы, являющиеся промежуточными продуктами биохимических реакций, ионы металлов переменной валентности, таких как железо, медь, марганец и др.

Проявление магнитного момента у электрона связано с тем, что электрон является заряженной частицей, и при вращении электрона вокруг своей оси (спиновое движение) возникает магнитное поле, направленное вдоль оси вращения. При помещении парамагнитного образца в магнитное поле магнитные моменты неспаренных электронов ориентируются в этом

поле, подобно тому, как это происходит с магнитными стрелками.

Магнитный момент неспаренного электрона во внешнем магнитном поле может ориентироваться двумя способами - по полю и против поля. Таким образом, если в исследуемой системе имеются неспаренные электроны, наложение внешнего магнитного поля приводит к разделению электронов по группам: магнитные моменты одних электронов ориентированы по полю, других – против.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

1. Д. Ингрэм Электронный парамагнитный резонанс в биологии [Текст]. Изд-во «Мир», 1972.
2. Свободные радикалы в биологических системах [Текст]. т.1, ст.88-175, 178-226. Изд-во «Мир», 1979.

3. Дж. Вертц и Дж. Болтон, Теория и практические приложения метода ЭПР [Текст], Москва: Мир,1975.

4. Современные методы биофизических исследований [Текст]. Практикум по биофизике, под редакцией А.Б. Рубина, Москва: Высшая школа, 1988.

5. Метод спиновых меток [Текст]. Теория и применение, под редакцией Л. Берлинера, Москва: Мир, 1979.

6. А.Н. Кузнецов, Метод спинового зонда, Москва [Текст]: Наука, 1976.

7. В.Е. Зубарев, Метод спиновых ловушек, Москва [Текст]: Издательство МГУ, 1984.

PAGE \* MERGEFORMAT 1

В основе магнитного резонанса лежит резонансное (избирательное) поглощение радиочастотного излучения атомными частицами, помещенными в постоянное магнитное поле. Большинство элементарных частиц, подобно волчкам, вращаются вокруг собственной оси. Если частица обладает электрическим зарядом, то при ее вращении возникает магнитное поле, т.е. она ведет себя подобно крошечному магниту. При взаимодействии этого магнитика с внешним магнитным полем происходят явления, позволяющие получить информацию о ядрах, атомах или молекулах, в состав которых входит данная элементарная частица. Метод магнитного резонанса представляет собой универсальный инструмент исследований, применяемый в столь различных областях науки, как биология, химия, геология и физика. Различают магнитные резонансы двух основных видов: электронный парамагнитный резонанс и ядерный магнитный резонанс.

Электронный парамагнитный резонанс (ЭПР) был открыт Евгением Константиновичем Завойским в Казанском Университете в 1944 году. Он заметил, что монокристалл , помещенный в постоянное магнитное поле (4 мТл) поглощает микроволновое излучение определенной частоты (около 133 МГц).

Суть данного эффекта заключается в следующем. Электроны в веществах ведут себя как микроскопические магниты. Если поместить вещество в постоянное внешнее магнитное поле и воздействовать на него радиочастотным полем, то в разных веществах они будут переориентироваться по-разному и поглощение энергии будет избирательным. Возврат электронов к исходной ориентации сопровождается радиочастотным сигналом, который несет информацию о свойствах электронов и их окружении.

Расщепление Зеемана соответствует радиочастотному диапазону. Ширина линий спектра расщеплённого состояния определяется взаимодействием спинов электронов с их орбитальными моментами. Это определяет время релаксационных колебаний атомов как результат их взаимодействия с окружающими атомами. Поэтому ЭПР может служить средством исследования структуры внутреннего строения кристаллов и молекул, механизма кинетики химических реакций и других задач.

Рис. 5.5 Прецессия магнитного момента (М) парамагнетика в постоянном магнитном поле .

Рис. 5.5 иллюстрирует явление прецессии электрона в магнитном поле. Под действием вращательного момента, создаваемого полем , магнитный момент совершает круговые вращения по образующей конуса с ларморовской частотой . При наложении переменного магнитного поля, вектор напряженности совершает круговое движение с ларморовской частотой в плоскости, перпендикулярной вектору . При этом происходит изменение угла прецессии, приводящее к опрокидыванию магнитного момента (М). Увеличение угла прецессии сопровождается поглощением энергии электромагнитного поля, уменьшение угла - излучением с частотой .

Практически удобнее использовать момент наступления резкого поглощения энергии внешнего поля при постоянной частоте и изменяемой индукции магнитного поля. Чем сильнее взаимодействие между атомами, молекулами тем шире спектр ЭПР. Это позволяет судить о подвижности молекул, вязкости среды (>).

Рис. 5.6 Зависимость поглощающей способности энергии внешнего поля веществом от величины его вязкости.

, , (5.4)

Гиромагнитное отношение.

Например, при частота электромагнитного воздействия должна находиться в пределах .

Данный метод, представляющий собой один из видов спектроскопии, применяется при исследовании кристаллической структуры элементов, химии живых клеток, химических связей в веществах и т.д.

На рис. 5.6 представлена структурная схема ЭПР-спектрометра. Принцип его работы основан на измерении степени резонансного поглощения веществом проходящего через него электромагнитного излучения при изменяющейся напряженности внешнего магнитного поля.

Рис. 5.7 Схема спектрометра ЭПР (а) и распределение силовых линий магнитного и электрического полей в резонаторе. 1 – генератор микроволнового излучения, 2 – волновод, 3- резонатор, 4 – магнит, 5 – детектор микроволнового излучения, 6 – усилитель сигнала ЭПР, 7 – регистрирующие устройства (ЭВМ или осциллограф).

Открытие ЭПР послужило основой для разработки ряда других методов изучения строения веществ, таких как акустический парамагнитный резонанс, ферро- и антиферромагнитный резонанс, ядерный магнитный резонанс. При явлении акустического парамагнитного резонанса переходы между подуровнями инициируются наложением высокочастотных звуковых колебаний; в результате возникает резонансное поглощение звука.

Применение метода ЭПР дало ценные данные о строении стекол, кристаллов, растворов; в химии этот метод позволил установить строение большого числа соединений, изучить цепные реакции и выяснить роль свободных радикалов (молекул, обладающих свободной валентностью) в появлении и протекании химических реакций. Тщательное изучение радикалов привело к решению ряда вопросов молекулярной и клеточной биологии.

Метод ЭПР – очень мощный исследовательский инструмент, он практически незаменим при изучении изменений в структурах, в том числе и в биологических. Чувствительность метода ЭПР очень высока и составляет парамагнитных молекул. На применении ЭПР основан поиск новых веществ для квантовых генераторов; явление ЭПР используется для генерации сверхмощных субмиллиметровых волн.